1.Q：PKMITO可以染植物細胞線(xiàn)粒體嗎

A：目前測試了幾種植物樣本，衣藻、花粉管都有成功的案例，根尖細胞和擬南芥葉片效果都不理想，所以一般不推薦使用PKMITO染料標記植物細胞線(xiàn)粒體。除了帶細胞壁的樣本存在透膜問(wèn)題，植物細胞線(xiàn)粒體內外膜電勢差也比動(dòng)物細胞小，所以也可能存在標記問(wèn)題。原生質(zhì)體可以染，但效果一般。

2.Q：維拉帕米的用法

A：對于一些不容易透膜標記靶點(diǎn)的染料，在不影響實(shí)驗設計的前提下，我們推薦使用維拉帕米（一種鈣通道阻滯劑）增加染料在細胞內的保留，以提高染色效率，染料是否推薦搭配使用請參考染料的網(wǎng)站介紹或網(wǎng)站產(chǎn)品詳情頁(yè)的電子版說(shuō)明書(shū)。

具體用法一般建議是1-10μM的終濃度，在整個(gè)染色到拍攝的全過(guò)程中都使用，例如在配置染色工作液時(shí)即加入適當濃度的維拉帕米，然后進(jìn)行孵育染色，在染色結束如果進(jìn)行進(jìn)一步清洗，那么在清洗后仍然加入適當濃度的維拉帕米，以保證長(cháng)時(shí)間拍攝時(shí)的穩定性。推薦貨號：麥克林 V875827;中國上海

3.Q：線(xiàn)粒體探針染了細胞，熒光能保留多久

A：在以往的實(shí)驗中，用PKMITO染料染完色后，細胞傳一代基本都還能保留熒光，所以幾天之內基本上都有熒光。

4.Q：actin染料和fastact有什么區別

A：這兩款染料分子上帶的定位基團不一樣，fastact系列是迭代的更優(yōu)化的版本，生物相容性更好，細胞毒性更低。但化學(xué)結構的優(yōu)化不代表在每種生物樣本中都能帶來(lái)優(yōu)化的效果，成像最終效果或許沒(méi)有質(zhì)的差別。

5.Q：spirochrome的染料能不能用在植物或者海洋生物中

A：膜張力探針可以用在植物細胞上，其他染料不能。Tag類(lèi)的染料可以標記，但需要轉染表達的操作。“All our probes do not work in live plants and whole marine organisms (e.g. sea urchin embryos, jellyfish, sea star, etc) with the exception of Flipper-TR, which has been shown to work in plants.It seems the probe do not penetrate into the cells due to additional barriers (e.g. cell wall)”

6.Q：PKZinc系列幾種染料的區別

A：PKZnR-5的親和力最強 信噪比也最高 所以檢測信號的效果最好；換句話(huà)說(shuō)1能做的實(shí)驗5理論上都能做的更好，R1-R5本質(zhì)區別就是親和力，R1 FR1/2/3的親和力都一樣 都比R5低不少。

7.Q：幾款線(xiàn)粒體染料有什么區別

A：PKMITO系列四款產(chǎn)品：前三個(gè)是活細胞染料，是最好用熱度最高的，它們有兩個(gè)區別：一是激發(fā)通道不同，成像質(zhì)量都一樣，是超分辨水平的染料，抗淬滅、低光毒性；二是orange這款更適合做STED成像，另外兩個(gè)通道不適合拍STED；第四款帶FIX后綴的是可固定版本染料，也需要活細胞染色，染完后可以固定，但是這款染色沒(méi)有活細胞染料易用，對技術(shù)要求更高一些，摸條件的難度更高。

PK Mito Orange Fix這款染料的使用難度大，不適合做超分辨比較少的用戶(hù)，它的透膜效率在一些細胞種類(lèi)上較低，染色條件不好摸，僅照著(zhù)說(shuō)明書(shū)的話(huà)不容易做出來(lái)，而且不管哪個(gè)角度，固定后的線(xiàn)粒體，成像效果是不如活細胞的，因為不管怎么固定，線(xiàn)粒體肯定都會(huì )有損傷，所以這款染料只是提供了固定線(xiàn)粒體拍攝的一種解決方案，但并不具有普適性，只適合進(jìn)階玩家或者特殊實(shí)驗需求。當然我們還在開(kāi)發(fā)使用更簡(jiǎn)單的fix染料，提高fix染料的使用范圍，目前還在研發(fā)過(guò)程中。

HBmito這款產(chǎn)品作為線(xiàn)粒體染料的新品，主打遠紅通道的STED顯微鏡成像場(chǎng)景的應用，其作為活細胞染料的話(huà)，成像性能略遜于PKMITO系列，但PKMITO系列不支持遠紅通道的STED應用；而且HBmito是允許固定的，固定后的效果比mitotracker稍好一些，固定后是否能做超分辨，我們還在測試。

8.Q：線(xiàn)粒體染色后背景過(guò)高或者線(xiàn)粒體形態(tài)不好有哪些可能，怎么優(yōu)化？

A：背景過(guò)高，導致線(xiàn)粒體信號太強看不出來(lái)形態(tài)，首先考慮染色濃度太高了，可以將染色濃度降低一些，考慮1：2000或者更低（根據實(shí)際成像結果或者信號強度判斷），還有不要室溫染色，線(xiàn)粒體本來(lái)就是對環(huán)境敏感的細胞器，除非樣品本身孵育溫度就是室溫，否則要在37℃，其次在染完色后，可以用共聚焦設備/模式看看染色效果，看一是背景是否過(guò)高，二是線(xiàn)粒體形態(tài)是否良好，如果都不錯，清洗1-2次后換上新的預熱的培養基，再孵育20-30min，這樣線(xiàn)粒體形態(tài)會(huì )更好，背景會(huì )更低。

超分辨成像是很綜合很注重細節的實(shí)驗，所謂三分染色七分拍，一定要注意樣本的狀態(tài)是否良好，樣本狀態(tài)對于成像結果的影響比想象中要大很多，也不必拘泥于說(shuō)明書(shū)步驟，因為實(shí)驗影響因素太多，說(shuō)明書(shū)只能提供一些基礎框架，這種操作上的寬容度既是超分辨實(shí)驗的的優(yōu)勢也是難點(diǎn)，一定是要參考實(shí)際成像效果進(jìn)行條件優(yōu)化的，優(yōu)化的目的是用最少的染料，完成染色標記需求，減少各種試劑對細胞的影響。

9.Q：有沒(méi)有內質(zhì)網(wǎng)染料

A：沒(méi)有，目前推薦的超分辨標記內質(zhì)網(wǎng)的方式為轉染熒光蛋白（超分辨門(mén)檻，適用于SIM顯微鏡并向下兼容）；或者利用蛋白標簽技術(shù)如Halo Tag蛋白標簽或者SNAP蛋白標簽，先利用標簽質(zhì)粒在內質(zhì)網(wǎng)上表達相應的tag，再利用CA或者BG系列產(chǎn)品去標記tag，這是一種穩定的間接標記手段，依賴(lài)于我們優(yōu)化的CA/BG系列探針，可達到穩定的超分辨成像效果（適用于STED、SIM顯微鏡并向下兼容）。

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