DNA恒溫快速擴增試劑盒（熒光型）使用說(shuō)明書(shū)

（貨號：WLE8202KIT）

原理概述：

本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術(shù)：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點(diǎn)形成D-loop區域，并開(kāi)始對DNA雙鏈進(jìn)行掃描；待找到與引物互補的目的區域后，復合體Rec/ssDNA解體的同時(shí)，聚合酶也結合到引物的3’末端，開(kāi)始鏈的延伸。本試劑盒在39 oC下，依賴(lài)核酸外切酶的作用，加入根據模版設計的特異的分子探針，使用熒光監測設備能實(shí)現對目標片段擴增過(guò)程的實(shí)時(shí)監控。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、反應時(shí)間短（僅需20 mins）等優(yōu)點(diǎn)，反應組分為干粉狀態(tài)，操作簡(jiǎn)便，易于保存。

可適用于各種品牌的熒光定量PCR儀、恒溫熒光擴增儀器等熒光檢測設備。

引物設計：

建議使用長(cháng)度在30-35 bp的引物，引物過(guò)短會(huì )影響擴增速度和檢測靈敏度；引物設計避免形成二級結構而影響擴增；擴增子長(cháng)度建議在150-300 bp，通常不超過(guò)500 bp。

熒光探針設計：

探針序列不與特異性引物識別位點(diǎn)重疊，長(cháng)度為46-52 nt，序列避免回文序列、內部二級結構和連續的重復堿基。探針共有四個(gè)修飾位點(diǎn)：距離5’端的≥35 nt的中部位置標記一個(gè)dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸外切酶的識別位點(diǎn)；THF位點(diǎn)的上游標記一個(gè)熒光基團，下游標記一個(gè)粹滅基團，兩個(gè)基團的間距為2-4 nt；THF距離3’末端≥15 nt，并且3’末端標記一個(gè)修飾基團，例如胺基、磷酸基團或C3-Spacer。

試劑盒組成：

試劑盒儲存：

運輸條件：低溫運輸；

儲存條件：儲存溫度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重壓、反復凍融；

產(chǎn)品有效期：14個(gè)月。

操作步驟：提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。

1) 每個(gè)干粉反應管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需完全融化混勻，否則會(huì )對實(shí)驗效果產(chǎn)生影響）；

2) 每個(gè)反應管分別加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對于多個(gè)反應、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應管中）；

3) 向反應管中依次加入11.5 μL ddH₂O和2 μL核酸模板（可根據核酸濃度調整加入的核酸模板體積，并相應調整加入的ddH₂O體積，至模板與ddH₂O總體積為13.5 μL）；

4) 最后向反應管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（請務(wù)必上下顛倒甩動(dòng)反應管8-10次進(jìn)行混勻；對于多個(gè)反應，建議將B buffer加至反應管的蓋子內側上下顛倒后混勻）；

5) 混勻后，將反應液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應管放入熒光檢測設備中。熒光檢測程序設置為：恒溫39 oC；每30 s采集一次FAM通道（信號采集通道的選擇與熒光探針設計一致）熒光值；反應時(shí)間20 mins。

注：如使用ABI系列PCR儀，請務(wù)必于passive reference和quencher處均選擇“none”。

*正對照反應單元體系配制：正對照模板加入2μL，加入4.6 μL正對照引物探針Mix（已包含探針和上/下游引物），其他組分參照體系配制。

注意事項：

1． 由于試劑盒靈敏度非常高，在進(jìn)行反應時(shí)請注意避免核酸污染，并設置空白對照；

2． 使用時(shí)請取出實(shí)驗所需的MIRA反應單元的數量，剩余部分請置于存儲條件下。

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