中文別名（Chinese synonym）  溴化噻唑藍四氮唑；3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍；

英文別名（English synonym） 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium Bromide;Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide;Thiazoyl blue tetrazolium bromide;

CAS號（CAS NO.） 298-93-1

分子式（Formula）  C18H16N5SBr

外觀(guān)（Appearance） 淡黃色至橙色粉末

分子量（Molecular weight）  414.3

純度（purity）   ≥98%

熔點(diǎn)（Melting point）187℃

溶解性（Solubility）     溶于水，甲醇

MTT 溶液的配制方法

         通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱(chēng)取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無(wú)酚紅的培養基中，用0.22μm濾膜過(guò)濾以除去溶液里的細菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的過(guò)程中，容器最好用鋁箔紙包住。實(shí)驗的時(shí)候我一般關(guān)閉超凈臺上的日光燈來(lái)避光，覺(jué)得這樣比較好。

         需要注意的是，MTT法只能用來(lái)檢測細胞相對數和相對活力，但不能測定細胞絕對數。在用酶標儀檢測結果的時(shí)候，為了保證實(shí)驗結果的線(xiàn)性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內。

         MTT一般最好現用現配，過(guò)濾后4oC避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長(cháng)期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)候現配，直接往培養板中加，沒(méi)必要一下子配那么多,尤其當MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對不能再用了。

MTT有致癌性，用的時(shí)候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無(wú)菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒(méi)有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者你不放心的時(shí)候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉.

配制MTT時(shí)用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：Nacl 8g ＋ Kcl 0.2g ＋ Na2HPO4 1.44g ＋ KH2PO4 0.24g調pH 7.4,定容1L。

普通MTT法實(shí)驗步驟：

1：接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養液配成單個(gè)細胞懸液，以每孔1000-10000個(gè)細

胞接種到96孔板，每孔體積200ul.

2: 培養細胞：同一般培養條件，培養3-5天（可根據試驗目的和要求決定培養時(shí)間）。

3：呈色：培養3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.繼續孵育4 h，

終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。

每孔加150ul DMSO，振蕩10min，使結晶物充分融解。

4：比色：選擇490nm波長(cháng)，在酶聯(lián)免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時(shí)間為

橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長(cháng)曲線(xiàn)。

藥物MTT法實(shí)驗步驟

貼壁細胞：

1: 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度 1000-

10000 孔，（邊緣孔用無(wú)菌PBS填充）。

2: 5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿(mǎn)孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，

細胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午

加藥.一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設3-5個(gè)復孔.建議設5個(gè)，否則難以反應真實(shí)情況

3: 5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀(guān)察。

4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，

可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。

5: 終止培養，小心吸去孔內培養液。

6: 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免

疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

7: 同時(shí)設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介

質(zhì)、培養液、MTT、二甲基亞砜）。

懸浮細胞：

1: 收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×106/ml，按次序將①補足的1640（無(wú)血清）培

養基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養液稀釋 (儲存液100mg/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測物10ul；④細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無(wú)菌水填充）。每板設對照（加100ml 1640）

2: 置37℃，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀(guān)察。

3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4 h。（懸浮細胞推薦使用

WST-1，培養4 h后可跳過(guò)步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）

4、離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。

5、同時(shí)設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養液、MTT、二甲基亞砜），每組設定3復孔。

注意事項：

(1) 選擇適當得細胞接種濃度。

(2) 避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養液進(jìn)行試驗。在呈色后盡量吸盡孔

內殘余培養液。

(3) 設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，

最后比色以空白調零。

(4) MTT實(shí)驗吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線(xiàn)關(guān)系。

(5) 用96孔板培養細胞做MTT測細胞活力,應該加多少1640培養基,多少MTT和DMSO合適

根據書(shū)上說(shuō)的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養液，便于

DMSO溶解甲臜顆粒進(jìn)行比色測定

(6) 一般每孔4000個(gè)細胞為宜，既細胞濃度在20000個(gè)/ml，MTT加20ul，作用四小時(shí)后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值

保存條件：

      4℃避光保存。

注意事項：

      本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。