產(chǎn)品信息

貨號	名稱(chēng)	規格
GMP-M062-01A	Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade	500U
GMP-M072-01A	mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase, GMP Grade	2500U
GMP -S062	SAM (32mM), GMP Grade	0.5ml
GMP-M062-01A	Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade	500U
M062-YH01-01A	Vaccinia Capping System	500U
M072	mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase	2500U/2500U×5
M082	Cap 1 Capping System	10T/100T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

      牛痘病毒加帽體系利用牛痘病毒加帽酶及相關(guān)組分，將7-甲基鳥(niǎo)苷帽結構（m7Gppp，Cap0）加到 RNA 的 5′ 末端。在真核生物中，該結構與mRNA的穩定、轉運和翻譯密切相關(guān)。使用酶促反應為RNA加帽是一種簡(jiǎn)單有效的方法，且帽結構與天然Cap 0結構完全一致，能顯著(zhù)改善用于體外轉錄、轉染和顯微注射的RNA的穩定性和翻譯能力。這種酶由兩個(gè)亞基（D1和D12）組成，D1亞基執行RNA三磷酸酶和鳥(niǎo)苷轉移酶的功能，D12亞基執行鳥(niǎo)嘌呤甲基轉移酶的功能，它們對于添加一個(gè)完整的Cap 0結構m7Gppp5′N(xiāo)都是必須的（圖1）。
      由牛痘病毒加帽酶構建的帶帽RNA產(chǎn)品具有“cap 0”結構。通過(guò)在加帽反應中同時(shí)使用mRNA Cap 2'-O-甲基轉移酶和牛痘病毒加帽酶，Cap 0-RNA可以轉化為“ cap 1”結構。 mRNA Cap 2'-O-甲基轉移酶通過(guò)將甲基從供體分子SAM轉移到cap 0- RNA 5’端緊鄰帽結構的第一個(gè)核苷酸的2'-O位置，從而從Cap 0-RNA制備Cap 1-RNA。


     圖1. 參與mRNA 加帽的酶促途徑。Cap 0 結構 RNA 的產(chǎn)生需要牛痘病毒加帽酶：該酶兼具三磷酸酶、鳥(niǎo)苷轉移酶和鳥(niǎo)嘌呤甲基轉移酶的功能。其中S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是甲基供體。一旦產(chǎn)生了Cap 0 結構，就可以通過(guò)2'-O-核糖甲基轉移酶進(jìn)一步修飾以產(chǎn)生Cap 1 結構。本圖引自Michael Beverly , Amy Dell, Parul Parmar, Leslie Houghton et al (2016). Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS. Anal Bioanal Chem. 

     本體系可用于 IVT RNA 的加帽反應，使加帽反應在 1h 之內完成，效率接近 100%，并且保證正確的方向。IVT 推薦使用近岸蛋白質(zhì) T7 High Yield RNA Transcription kit（貨號：E131）。 
產(chǎn)品用途：
體內或體外翻譯前 mRNA 的加帽和 mRNA 的 5’末端標記。 
提高 RNA 的翻譯效率； 
改善 mRNA 在顯微注射和轉染后的表達。 
應用實(shí)例：

注意事項：   
SAM：SAM 在pH 7-8，37°C條件下不穩定，需要在反應開(kāi)始之前新鮮配置。為避免 SAM 降解，該工作液需要保存于冰上。 
RNA：在加帽體系使用之前，應將體外轉錄反應產(chǎn)生的 RNA 進(jìn)行純化并溶解于 RNase-free 水中，不能將 RNA 溶解在 EDTA溶液或其他鹽溶液中。 
RNA 二級結構：一些 RNA 轉錄本可能形成穩定的二級結構（同源二聚體和發(fā)卡結構），如二級結構發(fā)生在轉錄本的 5'端會(huì )影響加帽效率。在與加帽酶反應之前加熱 RNA 可以去除轉錄產(chǎn)物 5′端的二級結構，如果轉錄產(chǎn)物的 5′端結構復雜，可以把加熱時(shí)間延長(cháng)至 10min，加帽反應時(shí)間可延長(cháng)至 60min。 
Cap 0-和 Cap 1-mRNA：Cap 0-和 Cap 1-mRNA 之間的差異在 RNA 5'端緊鄰帽結構的第一位核苷酸（N1）是否具有 2'-O-甲基。在高等真核細胞中，該甲基化是天然加帽過(guò)程的一部分，Cap 1 結構提高了 mRNA 的翻譯效率。

Poly(A) 尾：如果加帽的 RNA 需要添加 3'-poly(A)尾巴，可以使用近岸蛋白質(zhì) E. coli Poly(A) Polymerase（貨號：M012）進(jìn)行加尾。加帽和加尾后的 RNA 需在進(jìn)行 RNA 轉染實(shí)驗前做純化處理。 
RNase Inhibitor：在配置反應體系時(shí)，可以加入 0.5 μl 近岸蛋白質(zhì) RNase 抑制劑（貨號：E125），同時(shí)去掉等體積的 RNase-free水。 
For research and manufacturing use only.