產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

LwaCas13a 核酸酶(又名 C2c2)是依賴(lài)于 crRNA 介導的 RNA 內切核酸酶，來(lái)源于 Leptotrichia wadei 菌株。在靶標單鏈 RNA 存在 PFS 序列的情況下，可特異地識別并剪切靶標 RNA。此外，Cas13a 也具有反式剪切活性(即旁路剪切活性/附屬剪切活性)，即當 LwaCas13a 蛋白與 crRNA、靶標 RNA 結合形成三元復合物后，便會(huì )被激活針對非特異序列單鏈 RNA 的反式剪切活性，將體系中的任意序列單鏈 RNA 切碎。該活性也被用于靶標核酸的快速檢測試劑盒的開(kāi)發(fā)。例如，Broad 研究所的張鋒團隊便利用 Cas13a 蛋白開(kāi)發(fā)了名為“SHERLOCK”的下一代分子診斷系統(詳細信息請參考 PMID: 28408723)

產(chǎn)品組分

a. LwaCas13a Nuclease 濃度為 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 規格的總體積為 10 μL，1,000 pmol 規格的總體積為 100 μL；

b. Control Target RNAand crRNA應保存于-80℃并避免反復凍融，必須在 6 個(gè)月內使用，使用時(shí)建議取 0.5 μL 至每 20 μL 反應體系；

c. ssRNAReporter(FAM-BHQ1)應避光保存于-80℃并避免反復凍融，必須在 6 個(gè)月內使用，使用時(shí)建議取 0.5 μL 至每 20 μL 反應體系。

保存條件

   Control Target RNA and crRNA 以及 ssRNA Reporter(FAM-BHQ1)于-80℃儲存，其余組分-20℃儲存；≤ 0℃運輸。

活性定義

    在總體積為 20 μL 的 1 × HOLMES Buffer 2 [pH 7.6]反應體系中，37℃反應條件下，1 min 內剪切1 pmol ssRNA 探針所需的 Cas13a 酶量定義為 1 transU。

例：若某批次 LwaCas13a 酶的反式切割活性為 9.0 transU/pmol，則表明 1 pmol 的該批次 LwaCas13a酶可在 1 min 內，在上述指定的反應條件下，反式切割 9 pmol ssRNA 探針。本公司提供的 Cas 酶 transU數值詳見(jiàn)各批號的 COA 檢測報告。

實(shí)驗流程

1. 反式剪切實(shí)驗

*反式剪切體系中各組分的用量可以根據不同的實(shí)驗目的進(jìn)行調整，用量較少時(shí)可先將各組分稀釋后加入體系，LwaCas13a Nuclease 可用 1×HOLMES Buf er 2 稀釋?zhuān)♂尯笮枇⒓词褂茫ㄈ粢♂尯蟮?Cas13 酶長(cháng)期保存，請使用 Cas13 Dilution Buf er，#32013），crRNA、

Target RNA 及 ssRNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀釋?zhuān)珮O低濃度的 Target RNA（例如 LOD 實(shí)驗）建議用 0.1% Tween 20 稀釋并使用低吸附的離心管、吸頭等耗材。

*反式剪切體系中探針的用量和預期反應到達平臺期的時(shí)間可參考各批號 Cas 酶 transU 的具體數值，詳見(jiàn)本公司提供的 COA檢測報告。

    實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀檢測熒光信號，37℃反應，每 30 sec 采集一次熒光信號。

實(shí)驗結果

注意事項

    1. Cas13a 的順式剪切(cis-cleavage): Cas13a 在 crRNA 的引導下，特異性地剪切 target RNA，且對 target RNA的 PFS 序列要求并不嚴格。

2. Cas13a 的反式剪切(trans-cleavage): 當 target RNA 存在時(shí)，Cas13a/crRNA 與 target RNA 形成三元復合物(Cas13a/crRNA/target RNA)，同時(shí)，Cas13a 被激發(fā)反式剪切活性，將反應體系中任意序列的單鏈 RNA切碎。

3. 為防止 RNase 污染，請保持實(shí)驗區干凈整潔，操作時(shí)需穿戴干凈的手套、口罩，實(shí)驗所用槍頭、離心管等耗材均為 RNase-free。

4. Cas13a 蛋白對熱敏感，容易失活，應全程冰上配置反應體系，并在使用后立即將酶置于-20℃保存。

5. 本公司提供的 Cas13a 蛋白及反應緩沖液不含任何除 Cas13a 外的任何其它核酸酶活性。

6. 本產(chǎn)品僅供科研使用。