正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

PAL（EC4. 3 1 5）廣泛存在于各種植物和少數微生物中，是植物體內苯丙烷類(lèi)代謝的關(guān)鍵酶，與一些重要的次生物質(zhì)如木質(zhì)素、異黃酮類(lèi)植保素、黃酮類(lèi)色素等合成密切相關(guān)，在植物正常生長(cháng)發(fā)育和抵御病菌侵害過(guò)程中起重要作用。

測定原理：

PAL催化L-苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸和氨，反式肉桂酸在290nm處有最大吸收值，通過(guò)測定吸光值升高速率計算PAL活性。

組成：

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入4ml蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑4℃保存；

自備儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長(cháng)至290nm，蒸餾水調零。

2、 準備96孔UV板一塊（非普通酶標板，普通酶標板只能透過(guò)可見(jiàn)光，不能透過(guò)紫外光，檢測波長(cháng)小于340nm務(wù)必使用UV板）。

3、在EP管或96孔UV板中按順序加入下列試劑

混勻，30℃ 準確反應30min

混勻，靜置10min后， 290nm處記錄測定管吸光值A1和對照管吸光值A2，△A=A1-A2。

注意：對照管只要做一管

PAL活性計算：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白在每ml反應體系中每min使290nm下吸光值變化0.1為一個(gè)酶活性單位。

PAL（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（Cpr× V樣）÷0.1÷T =13.3×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織在每ml反應體系中每min使290nm下吸光值變化0.1為一個(gè)酶活性單位。

PAL（U/g鮮重）＝ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.1÷T =13.3×ΔA÷W

V反總：反應體系總體積，0.2ml； V樣：加入樣本體積，0.005ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。

用96孔板測定的計算公式如下

（1） 按蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白在每ml反應體系中每min使290nm下吸光值變化0.05為一個(gè)酶活性單位。

PAL（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.05÷T =26.6×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織在每ml反應體系中每min使290nm下吸光值變化0.05為一個(gè)酶活性單位。

PAL（U/g鮮重）＝ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.05÷T =26.6×ΔA÷W

V反總：反應體系總體積，0.2ml； V樣：加入樣本體積，0.005ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。