正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

H₂O₂是生物體內最常見(jiàn)的活性氧分子，主要由SOD和XOD等催化產(chǎn)生，由CAT和POD等催化降解。H₂O₂不僅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互轉化的樞紐。一方面，H₂O₂可以直接或間接地氧化細胞內核酸，蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細胞膜遭受損害，從而加速細胞的衰老和解體；另一方面H₂O₂也是許多氧化應急反應中的關(guān)鍵調節因子。

測定原理：

H₂O₂與硫酸鈦生成黃色的過(guò)氧化鈦復合物，在415nm有特征吸收。

試劑的組成和配制：

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入3ml濃鹽酸充分溶解備用。用不完的試劑4℃保存；(溶解時(shí)間較長(cháng)，約30min，可40℃-60℃加熱，務(wù)必提前準備)

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、丙酮100ml、濃鹽酸5ml、研缽和冰。

H₂O₂提取：

1、細菌或細胞樣品的制備：收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104個(gè)）：試劑一體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細菌或細胞加入1ml試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；用試劑一定容至1ml；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 組織樣品的制備：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿；轉移至EP管中，用試劑一定容至1ml，8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、 分光光度計預熱30min以上，調節波長(cháng)至415nm，蒸餾水調零。

2、 將試劑二、三和四37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

3、 在EP管中按順序加入下列試劑。

充分混勻，靜置5min后，20000g，25℃離心5min，棄上清，沉淀中加入：

加入試劑四溶解沉淀后，室溫靜置5min，取200μL轉移至微量石英比色皿或96孔板中測定415nm處吸光值A。對照管只要做一次即可。計算ΔA＝A測定-A對照。

注意事項

1、由于試劑一易揮發(fā)，試劑一必須先預冷再加，研磨時(shí)必須在冰上研磨。

2、本試劑盒中試劑的揮發(fā)性較高，請帶一次性手套和口罩。

H₂O₂含量計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標準條件下測定的回歸曲線(xiàn)，y = 0.7488x + 0.0006 (x為標準品濃度，μmol/ml；y為ΔA)。

2、血清（漿）中H₂O₂含量的計算：

H₂O₂含量（μmol/ml）＝(ΔA-0.0006) ÷0.7488=1.34×(ΔA-0.0006)

3、細菌、細胞或動(dòng)物組織中H₂O₂含量計算

（1）按照蛋白濃度計算

H₂O₂含量(μmol/mg prot)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(V1×Cpr)= 1.34×(ΔA-0.0006)÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2）按照樣本質(zhì)量計算

H₂O₂含量(μmol/g鮮重)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(W ×V1÷V2)= 1.34×(ΔA-0.0006)÷W

 (3 ) 按照細菌或細胞密度計算：

H₂O₂含量(μmol/10⁴)=[ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0027×(ΔA-0.0006)

V1：加入反應體系中樣本體積，0.25ml；V2：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數，500萬(wàn)。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、標準條件下測定的回歸曲線(xiàn)，y = 0.3744x + 0.0006  (x為標準品濃度，μmol/ml；y為ΔA)。

2、血清（漿）中H₂O₂含量的計算：

H₂O₂含量（μmol/ml）＝(ΔA-0.0006)÷0.3744=2.67×(ΔA-0.0006)

3、細菌、細胞或組織中H₂O₂含量計算

（1）按照蛋白濃度計算

H₂O₂含量(μmol/mg prot)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(V1×Cpr)=2.67×(ΔA-0.0006) ÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2）按照樣本質(zhì)量計算

H₂O₂含量(μmol/g鮮重)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(W ×V1÷V2)= 2.67×(ΔA-0.0006) ÷W

 (3 ) 按照細菌或細胞密度計算：

H₂O₂含量(μmol/10⁴)=[(ΔA-0.0006) ÷0.3744×V1]÷(500×V1÷V2)= 0.0054×(ΔA-0.0006)

V1：加入反應體系中樣本體積，0.25ml；V2：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數，500萬(wàn)。

注意：標曲線(xiàn)性范圍為0.1μmol/ml-2μmol/ml，吸光度ΔA線(xiàn)性范圍為0.03-1，若ΔA超過(guò)1則需要稀釋?zhuān)嬎愎匠艘韵鄳♂尡稊怠?/span>