正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

NOX（EC 1.6.99.3）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養細胞中，可在氧氣存在下，直接將NADH氧化為NAD。該酶不僅參與NAD的再生，而且與免疫反應密切相關(guān)。

測定原理：

NOX能夠將NADH氧化為NAD，NADH的氧化與2,6二氯酚靛藍（DCPIP）的還原相偶聯(lián)，藍色的DCPIP被還原為無(wú)色的DCPIP，在600nm下測定藍色DCPIP的還原速率計算出NADH氧化酶活性的大小。

組成：

試劑五：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入5ml蒸餾水，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線(xiàn)粒體蛋白的分離：

① 準確稱(chēng)取0.1g組織或收集500萬(wàn)細胞，加入1ml試劑一和10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿600g，4℃離心5min。

③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11100g，4℃離心10min。

④ 上清液即為除去線(xiàn)粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線(xiàn)粒體泄漏的NOX（此步可選做）。

⑤ 步驟④中的沉淀即為線(xiàn)粒體，加入200μl試劑二和2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復30次），用于NOX活性測定。

血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長(cháng)至600nm，蒸餾水調零。

2、 樣本測定

（1）試劑四于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl樣本、200μl試劑四和40μl試劑五，混勻，記錄600nm處20s時(shí)吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

NOX活力單位的計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）NOX活力的計算:

單位的定義：每ml血清（漿）在每ml反應體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/ml）＝ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T=2500×ΔA

2、組織、細菌或細胞中NOX活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每ml反應體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織在每ml反應體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T=505×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞在每ml反應體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/10⁴ cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T=1.01×ΔA

V反總：反應體系總體積，0.25ml； V樣：加入樣本體積，0.01ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量；500：細胞或細菌總數，500萬(wàn)。

b.使用96孔板測定的計算公式如下：

1、血清（漿）NOX活力的計算:

單位的定義：每ml血清（漿）在每ml反應體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/ml）＝ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T=5000×ΔA

2、組織、細菌或細胞中NOX活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每ml反應體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.005÷T=5000×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織在每ml反應體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.005÷T=1010×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞在每ml反應體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個(gè)酶活力單位。

NOX（U/10⁴ cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.005÷T=2.02×ΔA

V反總：反應體系總體積，0.25ml； V樣：加入樣本體積，0.01ml；V樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量；500：細胞或細菌總數，500萬(wàn)。