測定意義：

NADK（EC 2.7.1.23）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養細胞中，是目前所發(fā)現的生物體內惟一能夠催化NAD⁺磷酸化生成NADP+的酶，可催化NAD(H)以ATP或無(wú)機多聚磷酸[poly(P)]作為磷?；w進(jìn)行磷酸化反應，生成NADP(H)。因此，NAD激酶在合成NADP(H)以及調節NAD(H)與NADP(H)的平衡上具有重要作用。

測定原理：

NADK催化NAD⁺磷酸化，生成NADP⁺；NADP⁺可被6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為NADPH；在340 nm下測定NADPH增加速率?？煞从吵?/span>NADK活性的大小。

組成：

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 ml玻璃比色皿和蒸餾水。

樣本測定的準備：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細菌或細胞加入1ml提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟

1、分光光度計預熱30min以上，調節波長(cháng)至340nm，蒸餾水調零。

2、將試劑一和試劑二37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴15min以上。

3、工作液Ⅰ的配制：在試劑三中加入12ml試劑一，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

   工作液Ⅱ的配制：在試劑四中加入45ml試劑二，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

4、加樣表

充分混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴15min，立即煮沸

2min（蓋緊，防止水分散失）冰浴冷卻，10000g，25℃離心10min，取上清

加完試劑混勻，室溫靜置15min，340nm下測定吸光值，ΔA=A測定-A對照。

NADK活性計算：

1、血清（漿）NADK活力的計算:

單位的定義：每ml血清（漿）每分鐘生成1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=53.59×ΔA

2、組織、細菌或細胞中NADK活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=53.59×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=53.59×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

NADK（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.107×ΔA

V反總：反應體系總體積，5×10^-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，15 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wàn)。