正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

SH（EC 1.1.1.14）催化山梨醇脫氫生成果糖，是調控生物體內山梨醇含量的關(guān)健酶之一。

測定原理：

SH催化山梨醇脫氫生成果糖，同時(shí)還原NAD⁺生成NADH，測定340nm吸光度增加速率可以計算SH活性。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

1、細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細菌或細胞加入1ml提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長(cháng)至340nm，蒸餾水調零。

2、 樣本測定

（1）在試劑二中加入7.6ml試劑一和11.4ml蒸餾水充分溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴5min；用不完的試劑4℃保存一周；

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl樣本和190μl試劑二，混勻，立即記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

SH活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）SH活力的計算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

SH（nmol/min/ml）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=1608×ΔA

2、組織、細菌或細胞中SDH活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

SH（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

SH（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=1608×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

SH（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=3.216×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wàn)。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）SH活力的計算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

SH（nmol/min /ml）= [ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=3216×ΔA

2、組織、細菌或細胞中SH活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

SH（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

SH（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=3216×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

SH（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=6.426×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wàn)。