測定意義：

線(xiàn)粒體復合體Ⅴ又稱(chēng)F₁F₀-ATP合酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養細胞的線(xiàn)粒體中，由F1和F0兩個(gè)亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成，也可逆過(guò)程水解ATP。此外，復合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養菌和光合細菌中。復合體Ⅴ是線(xiàn)粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。

測定原理：

復合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi，通過(guò)測定Pi增加速率來(lái)測定復合體Ⅴ活性。

試劑的組成和配制

試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前每支加入1.3mL蒸餾水，充分溶解備用，用不完

的試劑仍-20℃保存;

試劑六：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入3mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；

試劑七：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨用前加入10mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；

試劑八：粉劑×1瓶, 4℃保存；臨用前加入10mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；

定磷試劑的配制：按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效，若是藍色則為磷污染（請根據需要，用多少配多少）。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

需自備的儀器和用品

可見(jiàn)分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線(xiàn)粒體蛋白的分離：

1、準確稱(chēng)取0.1g組織或收集500萬(wàn)細菌或細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將勻漿600g，4℃離心5min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

4、上清液即為除去線(xiàn)粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線(xiàn)粒體泄漏的復合體Ⅴ（此步可選做）。

5、步驟4中的沉淀即為線(xiàn)粒體，加入800uL試劑二和8uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復30次），用于復合體Ⅴ酶活性測定。

測定步驟：

1、酶促反應

混勻， 37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）準確水浴30min

混勻，4000g，25℃離心10min，取上清液

2、定磷

混勻，室溫靜置10min左右，在660nm處讀取A測定管和A對照管，計算ΔA=A測定管-A對照管。

復合體Ⅴ活性計算

標準條件下測定的回歸方程為y = 1.274x + 0.004；x為標準品濃度（mmol/L），y為A值。

1、組織中復合體Ⅴ活性的計算:

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無(wú)機磷定義為一個(gè)酶活性單位。

 復合體Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(V樣×Cpr) ÷T

                         =62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無(wú)機磷定義為一個(gè)酶活性單位。

 復合體Ⅴ活性（nmol/min /g 鮮重）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T =50.7× (ΔA-0.004) ÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無(wú)機磷定義為一個(gè)酶活性單位。

復合體Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.101× (ΔA-0.004)

V反總：反應體系總體積，3×10-4 L； V樣：加入樣本體積，0.125 mL；V樣總：加入提取液體積，0.808 mL；T：反應時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數，500萬(wàn)。