正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

蔗糖轉化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解為果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代謝關(guān)鍵酶之一。根據最適 pH，Ivr分為酸性轉化酶（AI）和中性轉化酶（NI）兩種類(lèi)型。                           

AI的最適pH為3～5。AI分為可溶性AI(S-AI)和細胞壁不溶性AI（B-AI）兩種類(lèi)型。S-AI主要存在于細胞液泡或自由空間中，最適 pH 為4.5~5.0（酸性），通過(guò)降解液泡中蔗糖，調節液泡中蔗糖的利用和果實(shí)內糖類(lèi)的積累。

測定原理：

S-AI催化蔗糖降解產(chǎn)生還原糖，進(jìn)一步與3,5－二硝基水楊酸反應，生成棕紅色氨基化合物，在510nm有特征光吸收，在一定范圍內510nm光吸收增加速率與S-AI活性成正比。

組成：

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入10ml試劑一充分溶解備用；用不完的試劑4℃保存;

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。12000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長(cháng)至510nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定，（在EP管中依次加入下列試劑）：

混勻， 37℃準確水浴30min后，95℃水浴10min（蓋緊，以防水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變）

混勻，95℃水浴10min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻，取200μl至微量石英比色皿或96孔板中， 510nm處記錄各管吸光值A，如果吸光值大于2，可以用蒸餾水稀釋后測定(計算公式中乘以相應稀釋倍數)，ΔA=A測定-A對照。每個(gè)測定管需設一個(gè)對照管。

S-AI活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為y = 0.0016x -0.001；x為標準品濃度（μg/ml），y為吸光值。

（1）按蛋白濃度計算：

單位的定義：37℃每mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

S-AI活性（μg/min/mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr

（2）按鮮重計算：

單位的定義：37℃每g組織每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

S-AI活性（μg/min/g鮮重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷W

V1：加入反應體系中樣本體積，0.05ml；V2：加入提取液體積，1ml；T：反應時(shí)間，30min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本鮮重，g。

b.用96孔板測定的計算公式如下

標準條件下測定的回歸方程為y = 0.0008x -0.001；x為標準品濃度（μg/ml），y為吸光值。

（1）按蛋白濃度計算：

單位的定義：37℃每mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

S-AI活性（μg/min/mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=41.6×(ΔA +0.001) ÷Cpr

（2）按鮮重計算：

單位的定義：37℃每g組織每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

S-AI活性（μg/min/g鮮重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(W ×V1÷V2)÷T=41.6×(ΔA +0.001) ÷W

V1：加入反應體系中樣本體積，0.05ml；V2：加入提取液體積，1ml；T：反應時(shí)間，30min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本鮮重，g。