正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

UDPG焦磷酸化酶是生物體糖原合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶。在葡萄糖合成糖原前催化葡萄糖活化，將1-磷酸葡萄糖與UTP分子合成為UDP-葡萄糖（UDPG）。

測定原理：

UGP可逆催化反應生成1磷酸葡萄糖，在磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下將NADP轉化為NADPH，340nm的吸光值增加速率反映了UGP活性。

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存。臨用前加2ml蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存。臨用前加2ml蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑四：粉劑×1瓶，-20℃保存。臨用前加2ml蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

自備儀器和用品：

天平、低溫離心機、研缽、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板

酶液提?。?/span>

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g，加入1ml提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置冰上待測。

2. 細胞：按照細胞數量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細胞加入1ml提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置冰上待測。

3. 液體：直接檢測。

測定操作：

1. 紫外分光光度計/酶標儀預熱30min，調節波長(cháng)至340nm，蒸餾水調零。

2. 取微量石英比色皿/96孔板，依次加入100μl試劑一，20μl試劑二，20μl試劑三，20μl試劑四，20μl試劑五，20μl粗酶液，充分混勻，記錄340nm處30s的吸光值A1和330s的吸光值A2，△A=A2-A1

計算公式：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（nmol/min /g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

（3）按照細胞數量計算

酶活單位定義：每10⁴個(gè)細胞每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（nmol/min /10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷細胞數量

（4）按照液體體積計算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（nmol/min /ml）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T=321.54×ΔA

V反總：反應體系總體積，0.2ml；ε：NADPH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g

b.使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=643.08×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（nmol/min /g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=643.08×ΔA÷W

（3）按照細胞數量計算

酶活單位定義：每10⁴個(gè)細胞每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（nmol/min /10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×細胞數量÷V樣總) ÷T

=643.08×ΔA÷細胞數量

（4）按照液體體積計算

酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個(gè)酶活力單位。

UGP（nmol/min /ml）=ΔA÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T=643.08×ΔA

V反總：反應體系總體積，0.2ml；ε：NADPH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g