測定意義：

GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，與糖異生途徑、體內血糖濃度的維持和糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，在機體糖、脂、蛋白代謝紊亂疾病中發(fā)揮重要作用。

測定原理：

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、無(wú)機磷和NAD，340nm處測定NADH的減少量可反映GADPH活性的高低。

組成：

自備儀器和用品：

分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

組織樣本的前處理:

①總GAPDH酶提?。航ㄗh稱(chēng)取約0.1g樣本，加入1ml提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測定。

②胞漿和葉綠體GAPDH酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5～10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g樣本，加入1ml提取液一），冰浴勻漿后于4℃，200g離心5min，棄沉淀，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用于測定胞漿GAPDH酶活性，取沉淀加1ml提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時(shí)間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測定葉綠體中GAPDH酶活性。

建議測定總GAPDH酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的GAPDH，則按照步驟②提取粗酶液。

細菌或培養細胞的前處理：

先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴個(gè)）：提取液一體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細菌或細胞加入1ml提取液一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟

1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長(cháng)至340nm，蒸餾水調零。

2、 樣本測定

（1）工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)預熱10分鐘；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

（2）在試劑三中加入500μl蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入5μl樣本、5μl試劑三和190μl工作液，混勻，加入最后一個(gè)試劑的同時(shí)開(kāi)始計時(shí)，記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

GAPDH活性計算:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每一萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500 ×V樣÷V樣總) ÷T=2.572×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.005 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wàn)。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=2572×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=2572×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每一萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500 ×V樣÷V樣總) ÷T=5.144×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.005 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wàn)。