測定意義：

MDHAR催化MDHA還原生成AsA，在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。

測定原理：

MDHAR 催化 NADH 還原MDHA 生成 AsA和NAD⁺，NADH在340 nm有特征吸收峰，但是NAD⁺沒(méi)有。通過(guò)測定340 nm光吸收下降速率，來(lái)計算出MDHAR活性。

組成：

試劑三：粉劑×1瓶（棕色），4℃保存。臨用前加入3 ml蒸餾水充分溶解。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入2.5 ml蒸餾水充分溶解。

試劑五：液體15μl×1瓶，4℃保存。臨用前加3 ml試劑二充分溶解。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調式移液槍和雙蒸水

粗酶液提?。?/span>

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

. 細菌、真菌：按照細胞數量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細胞加入1ml試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；8000g ，4℃離心20min，取上清液置冰上混勻待測。

3.  血清等液體：直接測定。

MDHAR測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min，調節波長(cháng)到340 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預熱30 min。

3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μl試劑三、20μl試劑四、20μl試劑五和120μl試劑二，最后加入20μl上清液，迅速混勻后于340nm比色，記錄30s和150s的吸光值30s和150s的吸光值A1和A2，△A=A1-A2。

MDHAR活性計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

MDHAR活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹]÷（Cpr×V樣）÷T

= 804×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

MDHAR活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol NADH 為1U。

MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹]÷（W×V樣÷V樣總）÷T

= 804×△A ÷W

（3）按細胞數量計算

MDHAR活性單位定義：25℃中每10⁴個(gè)細胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

MDHAR (nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹÷（細胞數量×V樣÷V樣總）÷T

= 804×△A ÷ 細胞數量

（4）按液體體積計算

MDHAR活性單位定義：25℃中每毫升液體每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

MDHAR (nmol/min /ml) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹÷V樣）÷T

= 804×△A

ε：NADH摩爾消光系數，6220 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，0.2ml=2×10^-4L；V樣：加入反應體系中上清液體積，20μl=0.02ml；V樣總：提取液體積，1 ml；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/ml，蛋白質(zhì)濃度需要另外測定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量BCA試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；T：反應時(shí)間，2min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下：

(1). 按蛋白濃度計算

MDHAR活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹]÷（Cpr×V樣）÷T

= 1608×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

MDHAR活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol NADH 為1U。

MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹]÷（W×V樣÷V樣總）÷T

= 1608×△A ÷W

（3）按細胞數量計算

MDHAR活性單位定義：25℃中每10⁴個(gè)細胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

MDHAR (nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹÷（細胞數量×V樣÷V樣總）÷T

= 1608×△A ÷ 細胞數量

（4）按液體體積計算

MDHAR活性單位定義：25℃中每毫升液體每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

MDHAR (nmol/min /ml) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹÷V樣）÷T

=1608×△A

ε：NADH摩爾消光系數，6220 L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應體系總體積，0.2ml=2×10^-4L；V樣：加入反應體系中上清液體積，20μl=0.02ml；V樣總：提取液體積，1 ml；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/ml，蛋白質(zhì)濃度需要另外測定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量BCA試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；T：反應時(shí)間，2min。

注意事項：

臨用前配制的試劑未使用完的4℃保存，3天內使用完。