【產(chǎn)品用途】本產(chǎn)品可應用于核酸DNA 的快速擴增。

【檢測原理】本產(chǎn)品是基于重組酶介導鏈置換核酸擴增（Recombinase-aid Amplification，RAA）技術(shù)開(kāi)發(fā)的恒溫核酸擴增檢測試劑，在39℃恒溫條件下特異識別并擴增目標樣本的DNA片段，可用Genchek 熒光檢測儀實(shí)時(shí)監控擴增過(guò)程，5-20 min 即可完成擴增檢測。

【技術(shù)原理】重組酶介導鏈置換核酸擴增（Recombinase-aid Amplification，RAA），是一種恒溫核酸快速擴增技術(shù)。從細菌或真菌中 獲得的重組酶在常溫下可與引物DNA緊密結合，形成重組酶/引物復合體，侵入DNA雙鏈核酸模板，在侵入位點(diǎn)重組酶將雙鏈打開(kāi)，同時(shí)單鏈結合蛋白結合到被重組酶打開(kāi)的單鏈上，維持雙鏈模板處于開(kāi)鏈狀態(tài)。重組酶/引物復合體開(kāi)始對雙鏈進(jìn)行掃描，當引物在模板上搜索到與之完全匹配的互補序列時(shí)，重組酶/引物復合體解體，DNA聚合酶結合到引物的3’端，開(kāi)始合成新鏈。合成的新鏈又可以作為模板，最終擴增產(chǎn)物以指數級增長(cháng)，完成靶標基因的擴增。經(jīng)過(guò)熒光標記的探針與擴增產(chǎn)物結合，當探針被核酸外切酶酶切后發(fā)出熒光信號，可對擴增過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監控。本試劑盒具有快速、靈敏度高以及特異性強等優(yōu)點(diǎn)，反應組分已混合并冷凍干燥成反應干粉，操作簡(jiǎn)便，易于保存。

【引物設計與探針設計】

引物設計建議方法：RAA核酸擴增技術(shù)對引物設計的要求與常規PCR引物設計有一定的區別。由兩條寡核苷酸組成一對引物，分 別特異性識別一個(gè)核酸目標物的上下游核苷酸序列；引物長(cháng)度在30-35 nt之間，序列中無(wú)回文序列、連續單堿基重復序列和內部二級結 構區；引物Tm值不作為設計時(shí)主要考慮因素；最佳引物對需通過(guò)試驗優(yōu)化篩選得到，要求其擴增產(chǎn)物為單一條帶，無(wú)非特異性擴增和明顯的引物二聚體。

探針設計建議方法：探針序列不與引物識別位點(diǎn)重疊，長(cháng)度在46-52nt之間，序列避免回文序列、內部二級結構和連續的重復堿基； 共有四個(gè)修飾位點(diǎn)，距離5’端的≥28nt的中部位置標記一個(gè)dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸外切酶的識別位點(diǎn)；THF位點(diǎn)的上游標記一個(gè)熒光基團，下游標記一個(gè)淬滅基團，兩個(gè)基團的間距為2-4 nt，THF 距離3’末端≥15nt；3’末端標記一個(gè)修飾基團，例如胺基、磷酸基團、生物素、生物素-TEG 或C3-spacer。

建議：在開(kāi)展RAA （熒光型）擴增反應之前，先進(jìn)行引物的篩選試驗，以便得到較高的檢測靈敏度。

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)：B8202C3 DNA恒溫快速擴增試劑盒（RAA熒光型）.pdf (251.76 K)