產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述 

    ?；镱?lèi)器官金牌基質(zhì)膠是一種可溶性的基底膜基質(zhì)膠，這種基質(zhì)是通過(guò)基因編輯技術(shù)將多種表達膠原蛋白的基因序列插入到經(jīng)永生化處理的小鼠細胞體系中，并在實(shí)體中抽提出來(lái)的。它的主要成分是層粘連蛋白，接著(zhù)是膠原蛋白IV、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和巢蛋白?；啄せ|(zhì)也含有轉化生長(cháng)因子β、表皮生長(cháng)因子、類(lèi)胰島素生長(cháng)因子、成纖維細胞生長(cháng)因子和在中自然出現的其他生長(cháng)因子。

推薦應用

     此款基質(zhì)膠是篩選出的確保能進(jìn)行類(lèi)器官培養的基質(zhì)膠。如果遇到不能用其他類(lèi)型的基質(zhì)膠培養的類(lèi)器官，使用該系列基質(zhì)膠可以保證實(shí)驗的有效性和重現性。例如，小鼠腸道類(lèi)器官、肺類(lèi)器官、類(lèi)器官等。

產(chǎn)品參數

來(lái)源：小鼠

外觀(guān)：①顏色：含酚紅基質(zhì)膠表現為黃色-粉紅色，無(wú)酚紅基質(zhì)膠表現為半透明淡黃色； ②形態(tài)：標準型基質(zhì)膠4℃溶解后，呈透明流動(dòng)液態(tài)狀態(tài)；高濃度基質(zhì)膠0℃溶解后，呈透明流動(dòng)液態(tài)狀態(tài)，4℃久置呈半凝膠狀。

濃度多樣性： 蛋白濃度范圍在8~26mg/mL之間

內毒素： ≤ 4.5EU/ mL

凝膠時(shí)間：室溫條件下5-30min凝膠，溫度22°C至37°C時(shí)成膠速度加快

2D/3D應用非常廣泛：干細胞研究(分化、維持）、研究（侵襲）、 3D細胞培養（類(lèi)器官、3D細胞球）、體內植入（皮下、血管生成、栓塞）

產(chǎn)品質(zhì)量控制規范

• 通過(guò)小鼠抗體產(chǎn)物（MAP）檢測進(jìn)行常規小鼠菌落病原體篩選

• 提取自不含LDEV的小鼠細胞

• 對包括LDEV在內的多種病原體進(jìn)行廣泛的PCR檢測， 確保對生產(chǎn)過(guò)程中使用的原材料進(jìn)行嚴格控制

• 對細菌、真菌和支原體進(jìn)行檢測，確保陰性

• 使用BCA方法測定蛋白濃度

• 使用血清學(xué)方法檢測內毒素水平

• 在37℃下進(jìn)行14天的凝膠穩定性測試

• 每批次產(chǎn)品進(jìn)行生物學(xué)功能驗證（類(lèi)器官培養與分化實(shí)驗；皮下實(shí)驗；干細胞培養；血管生成實(shí)驗等）

• 對包括LDEV在內的多種病原體進(jìn)行廣泛的PCR檢測， 確保對生產(chǎn)過(guò)程中使用的原材料進(jìn)行嚴格控制

使用注意事項

實(shí)驗環(huán)境

 • 環(huán)境溫度：20–25℃ ；環(huán)境濕度：40–60%。

 • 請穿戴個(gè)人防護裝置，注意實(shí)驗室安全。

溫度控制  

• 基質(zhì)膠產(chǎn)品儲存在-20℃時(shí)是穩定的。通過(guò)分裝并一次性使用分裝物來(lái)盡可能減少產(chǎn)品的凍融次數。在-20℃冰箱中儲存分裝物直到準備使用。請不要儲存在無(wú)霜冰箱中。請務(wù)必保持產(chǎn)品的凍存狀態(tài)。

• 因為?；镱?lèi)器官金牌基質(zhì)膠 在10℃以上會(huì )開(kāi)始凝膠化。所以需謹記：?；镱?lèi)器官金牌基質(zhì)膠 和所有與?；镱?lèi)器官金牌基質(zhì)膠 接觸的培養皿或培養基都應該預冷。在實(shí)驗的全部過(guò)程中請務(wù)必保持?；镱?lèi)器官金牌基質(zhì)膠 處于冰上。

避免污染

• 實(shí)驗操作人員需嚴格區分實(shí)驗操作臺、清潔區和污染區，確保插取吸頭、加樣、丟棄吸頭的動(dòng)作呈單向流動(dòng)。

• 實(shí)驗后使用含 0.5% 次氯酸的消毒液對實(shí)驗操作區消毒。

其他

• 請將基質(zhì)膠產(chǎn)品小瓶淹沒(méi)在碎冰中，并放置在4℃冰箱里過(guò)夜解凍?；锘|(zhì)膠，蛋白濃度高時(shí)可能需要更多時(shí)間。請將?；镱?lèi)器官金牌基質(zhì)膠 全程保持在冰上。無(wú)論是開(kāi)蓋取用產(chǎn)品或者對產(chǎn)品進(jìn)行分裝，請保持無(wú)菌操作。

• 操作過(guò)程中，需使用預冷的移液管輕柔地吹打混勻?；镱?lèi)器官金牌基質(zhì)膠 以確保其均勻性。將?；镱?lèi)器官金牌基質(zhì)膠 分裝到離心管中，每當?；镱?lèi)器官金牌基質(zhì)膠 堵塞吸頭和/或移液管測量不精確時(shí)請更換吸頭。如果將產(chǎn)品放置在4℃的冰上 24-48個(gè)小時(shí)，凝膠化的?；镱?lèi)器官金牌基質(zhì)膠 可能會(huì )被重新水化。

操作說(shuō)明

分裝操作說(shuō)明

    基質(zhì)膠產(chǎn)品儲存在-20℃時(shí)是穩定的。通過(guò)分裝并一次性使用分裝物來(lái)盡可能減少產(chǎn)品的凍融次數。以下為實(shí)驗操作者進(jìn)行分裝操作說(shuō)明。

1.將基質(zhì)膠置于預冷盒或碎冰中，放入 4℃冰箱，過(guò)夜解凍。

2.將無(wú)菌離心管、無(wú)菌槍頭等接觸基質(zhì)膠的耗材放預冷盒中或冰箱中預冷，分裝前將融化好的基質(zhì)膠表面清潔后放入預冷盒或碎冰上。

3.在潔凈工作臺中，用1mL移液槍吸取250µL基質(zhì)膠到離心管里(或根據每次用量多少進(jìn)行分裝)，標注好信息，操作過(guò)程中盡量保持低溫，縮短操作時(shí)間。

4.分裝完成后放冰盒中，防止傾倒，并于冰箱保存。分裝后放置于-20℃冰箱中儲存備用。請不要儲存在自動(dòng)除霜的冰箱中儲存。使用前將基質(zhì)膠插入預冷盒或碎冰中，并放置于4°C冰箱中，在冰上過(guò)夜解凍，使基底膜基質(zhì)膠在穩定的低溫環(huán)境中緩慢充分融化。

使用方法說(shuō)明

包被涂層方法   

    ?；镱?lèi)器官金牌基質(zhì)膠可以以幾種方式使用。薄層凝膠法適用于在凝膠頂部接種細胞，厚層凝膠法允許您在三維基質(zhì)內培養細胞，薄層包被法(不凝膠化)給您提供了復雜的蛋白質(zhì)層，您可以在其上培養細胞。您的選擇基于您想要實(shí)現的最終結果，無(wú)論是細胞生長(cháng)、附著(zhù)還是分化。

一、薄層凝膠法

1.依照推薦的方法解凍?；锘啄せ|(zhì)。使用預冷的移液管，將?；?基底膜基質(zhì)混合至均勻。

2.將培養板放置在冰上，以 50 µl/cm2 向生長(cháng)表面加入?；?基底膜基質(zhì)。

3.將培養板放置在 37 ℃，30 分鐘。

4.如果有必要的話(huà)，請在使用無(wú)血清培養基輕柔漂洗前吸出未結合的材料。請確保移液器的吸頭不要刮擦包被的表面。培養板現在可以使用了。

二、薄層包被法

1.依照推薦的方法解凍?；锘啄せ|(zhì)。使用預冷的移液管，將?；?基底膜基質(zhì)混合至均勻。

2.使用無(wú)血清培養基將?；锘啄せ|(zhì)稀釋到需要的濃度。對于您的實(shí)驗應用，您應該完成以經(jīng)驗為主的研究來(lái)確定您的最適包被濃度。

3.向被包被的容器中加入稀釋的?；?基底膜基質(zhì)。加入的量應該足以容易地覆蓋整個(gè)生長(cháng)表面。在室溫下培養 1 個(gè)小時(shí)。

4.吸出未結合的材料并使用無(wú)血清培養基輕柔地漂洗。培養板現在可以使用了。

三、厚層凝膠法

1.依照推薦的方法解凍?；锘啄せ|(zhì)。使用預冷的移液管，將?；?基底膜基質(zhì)混合至均勻。

2.將培養板放置在冰上。向?；锘啄せ|(zhì)中加入細胞并使用預冷的移液管懸浮。以150-200µl/cm2 向生長(cháng)表面加入?；?基底膜基質(zhì)。

3.將培養板放置在37℃，30分鐘?，F在可以添加培養基了。細胞也可以培養在這一凝膠的頂部。

細胞復蘇：

   使用細胞復蘇溶液在冰上 7 小時(shí)內解聚?；锘啄せ|(zhì)能夠實(shí)現將生長(cháng)在?；锘啄せ|(zhì)上的細胞最有效地復蘇，或者使用中性蛋白酶，考慮到連續培養，中性蛋白酶作為一種金屬酶可以分散細胞。

應用操作說(shuō)明

   以下以小鼠小腸類(lèi)器官原代建立實(shí)驗為例來(lái)進(jìn)行?；镱?lèi)器官金牌基質(zhì)膠的應用實(shí)驗操作說(shuō)明。

一、實(shí)驗目的

1.1熟練掌握小鼠小腸類(lèi)器官原代建立技術(shù)。

1.2了解掌握小鼠多種組織來(lái)源類(lèi)器官原代建立技術(shù)。

1.3觀(guān)察記錄小鼠小腸原代類(lèi)器官生長(cháng)、擴增過(guò)程中類(lèi)器官形態(tài)的變化。

二、實(shí)驗原理

   本實(shí)驗策略采取從成體干細胞中建立和維持小鼠小腸類(lèi)器官的方法。小鼠小腸類(lèi)器官主要由干細胞、腸祖細胞和腸絨毛細胞、潘氏細胞、杯狀細胞和少量腸內分泌細胞組成，在自我更新能力、組織結構、細胞類(lèi)型和功能方面，小鼠小腸類(lèi)器官重現了體內小腸上皮的特征，因此是腸道穩態(tài)和疾病機制研究的理想體外模型。

三、實(shí)驗儀器、材料、試劑

1、儀器：生物安全柜、細胞培養箱、低溫水平式離心機、倒置顯微鏡、低溫冰箱、搖床

2、材料：細胞培養板（規格為 24 孔、48 孔和 96 孔）、離心管（規格為 1.5 mL、15 mL 和 50 mL）、細胞培養皿（直徑規格為 2.5 cm、6 cm和10 cm）、移液器（規格為 2.5 μL、10 μL、20 μL、200 μL、1000 μL 和 5000 μL）、無(wú)菌吸頭（規格為 10 μL、200 μL 和 1000 μL）、無(wú)菌鑷子、無(wú)菌組織剪、70μm細胞過(guò)濾器、手術(shù)刀片

3、實(shí)驗試劑：小鼠小腸類(lèi)器官培養試劑盒、EDTA (0.5M, pH 8.0) 、潤洗液、基礎培養基、基質(zhì)膠、DPBS

四、實(shí)驗內容與方法

4.1 實(shí)驗前準備：

Ø 小鼠小腸類(lèi)器官培養試劑盒、基質(zhì)膠4℃化凍

Ø 小鼠小腸類(lèi)器官完全培養基的制備：將200μL Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)，40μL Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x) 加至 9.76mL Mouse Intestinal Organoid Basal Medium 中，充分混合，配制成 10mL 小鼠小腸類(lèi)器官完全培養基。 室溫平衡，可在 2-8°C 儲存，建議在兩周內使用。

Ø 準備足量添加1%雙抗的DPBS

Ø 準備足量添加0.1%BSA的DPBS

Ø 配制5mM EDTA溶液：4mL預冷DPBS溶液加40μL 0.5M EDTA溶液pH8.0，置冰上備用。

4.2 取樣：小鼠斷頸處死，表面噴灑酒精殺菌。在無(wú)菌條件下取出近胃端3~10cm腸組織，用鑷子去除腸道外部的腸系膜、脂肪，放入4℃預冷的含雙抗的DPBS溶液中。

4.3 清洗：使用手術(shù)剪將腸管剪開(kāi)，腸腔面朝上，一只手使用手術(shù)鑷夾住腸組織一端，另一只手使用手術(shù)刀片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后，將腸組織置于新的含 DPBS 的培養皿中清洗，重復清洗2次。 將清洗后的小腸組織剪碎至2mm寬，轉移至新的培養皿中，用DPBS清洗2遍。

4.4 消化：將清洗好的腸段轉移至含有5mmol/L EDTA 的預冷 DPBS 中消化，置于4℃孵育20~30min，消化20分鐘可用移液器輕柔吹打腸段，取上清顯微鏡下觀(guān)察，待上清出現完整隱窩即可終止消化，若無(wú)隱窩可適當延長(cháng)消化時(shí)間。

4.5 清洗：消化完成后，將組織碎片轉移到新的含 DPBS 的培養皿中清洗，重復2次以去除 EDTA。 

4.6 重懸：用 5mL 移液管在預冷的0.1%BSA的DPBS的培養皿或 50mL 離心管中吹打、重懸組織碎片，使組織反復穿過(guò)移液管尖以產(chǎn)生機械剪切力從而使隱窩與基底層分離，取一部分懸液鏡檢，當可以看到大量的隱窩樣結構后，停止吹打，并對吹打后的組織懸液進(jìn)行70μm濾網(wǎng)過(guò)濾。

4.7 收集：收集穿過(guò)濾網(wǎng)的組織懸液，300g 離心力 4℃離心3min。

4.8 計數：棄上清，使用1mL0.1%BSA的DPBS重懸組織沉淀，取20μL 懸液進(jìn)行鏡檢和隱窩計數，計數完成后吸取包含所需隱窩量的懸液，300g 離心力 4℃離心3min，棄上清后置于冰上。

4.9 用適量的Matrigengel Matrix重懸組織沉淀，推薦重懸密度為每10μL Matrigengel Matrix懸液包含70至100個(gè)隱窩，重懸后置于冰上，重懸時(shí)間不超過(guò)30s以避免Matrigengel Matrix過(guò)早凝固。

    注意： Matrigengel Matrix稀釋比例應在70%以上以保證培養過(guò)程中Matrigengel Matrix的結構穩定性。

4.10 將  Matrigengel Matrix和組織細胞的混合懸液點(diǎn)入24孔板底部正中央，每孔 30μL 左右，避免懸液接觸孔板側壁。

    注意：為防止 Matrigengel Matrix室溫凝固，此步驟應盡快完成。

4.11 將接種完成后的培養板至于 37℃二氧化碳恒溫培養箱中，孵育 15min 左右待 Matrigengel Matrix 凝固。 

待 Matrigengel Matrix完全凝固后，沿壁緩慢加入已配制好的小鼠小腸類(lèi)器官完全培養基，24孔板每孔500μL，避免破壞已凝固結構。

4.12將24孔板置于 37℃二氧化碳培養箱中培養。

4.13每3天更換一次培養基，更換培養基時(shí)應避免破壞 Matrigengel Matrix。

4.14密切監測類(lèi)器官生長(cháng)狀態(tài)，理想情況下，小鼠小腸類(lèi)器官應在5至7天內建成。