產(chǎn)品信息

貨號	產(chǎn)品名稱(chēng)	規格	儲存/運輸條件
082777	干細胞金牌基質(zhì)膠	10mL	≤-20°C
0827775	干細胞金牌基質(zhì)膠	5mL	≤-20°C
082777T	干細胞金牌基質(zhì)膠	1mL	≤-20°C

 產(chǎn)品描述 

    ?；锔杉毎鹋苹|(zhì)膠是一種可溶性的基底膜基質(zhì)膠，這種基質(zhì)是通過(guò)基因編輯技術(shù)將多種表達膠原蛋白的基因序列插入到經(jīng)永生化處理的小鼠細胞體系中，并在實(shí)體中抽提出來(lái)的。它的主要成分是層粘連蛋白，接著(zhù)是膠原蛋白IV、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和巢蛋白?；啄せ|(zhì)也含有轉化生長(cháng)因子β、表皮生長(cháng)因子、類(lèi)胰島素生長(cháng)因子、成纖維細胞生長(cháng)因子和在中自然出現的其他生長(cháng)因子。

推薦應用

    干細胞金牌基質(zhì)膠是一種成熟的hES培養底物。它與特定的培養基結合使用來(lái)培養干細胞(例如，hESC, iPSC)。此款干細胞金牌基質(zhì)膠提供了胚胎干細胞和誘導多能干細胞滋養層培養所需的重復性和一致性，也可用于體內分化研究，如畸形成。

產(chǎn)品參數

來(lái)源：小鼠

外觀(guān)：①顏色：含酚紅基質(zhì)膠表現為黃色-粉紅色，無(wú)酚紅基質(zhì)膠表現為半透明淡黃色； ②形態(tài)：標準型基質(zhì)膠4℃溶解后，呈透明流動(dòng)液態(tài)狀態(tài)；高濃度基質(zhì)膠0℃溶解后，呈透明流動(dòng)液態(tài)狀態(tài)，4℃久置呈半凝膠狀。

濃度多樣性： 蛋白濃度范圍在8~26mg/mL之間

內毒素： ≤ 4.5EU/ mL

凝膠時(shí)間：室溫條件下5-30min凝膠，溫度22°C至37°C時(shí)成膠速度加快

2D/3D應用非常廣泛：干細胞研究(分化、維持）、研究（侵襲）、 3D細胞培養（類(lèi)器官、3D細胞球）、體內植入（皮下、血管生成、栓塞）

產(chǎn)品質(zhì)量控制規范

• 通過(guò)小鼠抗體產(chǎn)物（MAP）檢測進(jìn)行常規小鼠菌落病原體篩選

• 提取自不含LDEV的小鼠細胞

• 對包括LDEV在內的多種病原體進(jìn)行廣泛的PCR檢測， 確保對生產(chǎn)過(guò)程中使用的原材料進(jìn)行嚴格控制

• 對細菌、真菌和支原體進(jìn)行檢測，確保陰性

• 使用BCA方法測定蛋白濃度

• 使用血清學(xué)方法檢測內毒素水平

• 在37℃下進(jìn)行14天的凝膠穩定性測試

• 每批次產(chǎn)品進(jìn)行生物學(xué)功能驗證（類(lèi)器官培養與分化實(shí)驗；皮下實(shí)驗；干細胞培養；血管生成實(shí)驗等）

• 對包括LDEV在內的多種病原體進(jìn)行廣泛的PCR檢測， 確保對生產(chǎn)過(guò)程中使用的原材料進(jìn)行嚴格控制

使用注意事項

實(shí)驗環(huán)境

 • 環(huán)境溫度：20–25℃ ；環(huán)境濕度：40–60%。

 • 請穿戴個(gè)人防護裝置，注意實(shí)驗室安全。

溫度控制  

• 基質(zhì)膠產(chǎn)品儲存在-20℃時(shí)是穩定的。通過(guò)分裝并一次性使用分裝物來(lái)盡可能減少產(chǎn)品的凍融次數。在-20℃冰箱中儲存分裝物直到準備使用。請不要儲存在無(wú)霜冰箱中。請務(wù)必保持產(chǎn)品的凍存狀態(tài)。

• 因為?；锔杉毎鹋苹|(zhì)膠 在10℃以上會(huì )開(kāi)始凝膠化。所以需謹記：?；锔杉毎鹋苹|(zhì)膠 和所有與?；锔杉毎鹋苹|(zhì)膠 接觸的培養皿或培養基都應該預冷。在實(shí)驗的全部過(guò)程中請務(wù)必保持?；锔杉毎鹋苹|(zhì)膠 處于冰上。

避免污染

• 實(shí)驗操作人員需嚴格區分實(shí)驗操作臺、清潔區和污染區，確保插取吸頭、加樣、丟棄吸頭的動(dòng)作呈單向流動(dòng)。

• 實(shí)驗后使用含 0.5% 次氯酸的消毒液對實(shí)驗操作區消毒。

其他

• 請將基質(zhì)膠產(chǎn)品小瓶淹沒(méi)在碎冰中，并放置在4℃冰箱里過(guò)夜解凍?；锘|(zhì)膠，蛋白濃度高時(shí)可能需要更多時(shí)間。請將?；锔杉毎鹋苹|(zhì)膠 全程保持在冰上。無(wú)論是開(kāi)蓋取用產(chǎn)品或者對產(chǎn)品進(jìn)行分裝，請保持無(wú)菌操作。

• 操作過(guò)程中，需使用預冷的移液管輕柔地吹打混勻?；锔杉毎鹋苹|(zhì)膠 以確保其均勻性。將?；锔杉毎鹋苹|(zhì)膠 分裝到離心管中，每當?；锔杉毎鹋苹|(zhì)膠 堵塞吸頭和/或移液管測量不精確時(shí)請更換吸頭。如果將產(chǎn)品放置在4℃的冰上 24-48個(gè)小時(shí)，凝膠化的?；锔杉毎鹋苹|(zhì)膠 可能會(huì )被重新水化。

操作說(shuō)明

分裝操作說(shuō)明

    基質(zhì)膠產(chǎn)品儲存在-20℃時(shí)是穩定的。通過(guò)分裝并一次性使用分裝物來(lái)盡可能減少產(chǎn)品的凍融次數。以下為實(shí)驗操作者進(jìn)行分裝操作說(shuō)明。

1.將基質(zhì)膠置于預冷盒或碎冰中，放入 4℃冰箱，過(guò)夜解凍。

2.將無(wú)菌離心管、無(wú)菌槍頭等接觸基質(zhì)膠的耗材放預冷盒中或冰箱中預冷，分裝前將融化好的基質(zhì)膠表面清潔后放入預冷盒或碎冰上。

3.在潔凈工作臺中，用1mL移液槍吸取250µL基質(zhì)膠到離心管里(或根據每次用量多少進(jìn)行分裝)，標注好信息，操作過(guò)程中盡量保持低溫，縮短操作時(shí)間。

4.分裝完成后放冰盒中，防止傾倒，并于冰箱保存。分裝后放置于-20℃冰箱中儲存備用。請不要儲存在自動(dòng)除霜的冰箱中儲存。使用前將基質(zhì)膠插入預冷盒或碎冰中，并放置于4°C冰箱中，在冰上過(guò)夜解凍，使基底膜基質(zhì)膠在穩定的低溫環(huán)境中緩慢充分融化。

使用方法說(shuō)明

包被涂層方法   

    ?；锔杉毎鹋苹|(zhì)膠 可以以幾種方式使用。薄層凝膠法適用于在凝膠頂部接種細胞，厚層凝膠法允許您在三維基質(zhì)內培養細胞，薄層包被法(不凝膠化)給您提供了復雜的蛋白質(zhì)層，您可以在其上培養細胞。您的選擇基于您想要實(shí)現的最終結果，無(wú)論是細胞生長(cháng)、附著(zhù)還是分化。

一、薄層凝膠法

1.依照推薦的方法解凍?；锘啄せ|(zhì)。使用預冷的移液管，將?；?基底膜基質(zhì)混合至均勻。

2.將培養板放置在冰上，以 50 µl/cm2 向生長(cháng)表面加入?；?基底膜基質(zhì)。

3.將培養板放置在 37 ℃，30 分鐘。

4.如果有必要的話(huà)，請在使用無(wú)血清培養基輕柔漂洗前吸出未結合的材料。請確保移液器的吸頭不要刮擦包被的表面。培養板現在可以使用了。

二、薄層包被法

1.依照推薦的方法解凍?；锘啄せ|(zhì)。使用預冷的移液管，將?；?基底膜基質(zhì)混合至均勻。

2.使用無(wú)血清培養基將?；锘啄せ|(zhì)稀釋到需要的濃度。對于您的實(shí)驗應用，您應該完成以經(jīng)驗為主的研究來(lái)確定您的最適包被濃度。

3.向被包被的容器中加入稀釋的?；?基底膜基質(zhì)。加入的量應該足以容易地覆蓋整個(gè)生長(cháng)表面。在室溫下培養 1 個(gè)小時(shí)。

4.吸出未結合的材料并使用無(wú)血清培養基輕柔地漂洗。培養板現在可以使用了。

三、厚層凝膠法

1.依照推薦的方法解凍?；锘啄せ|(zhì)。使用預冷的移液管，將?；?基底膜基質(zhì)混合至均勻。

2.將培養板放置在冰上。向?；锘啄せ|(zhì)中加入細胞并使用預冷的移液管懸浮。以150-200µl/cm2 向生長(cháng)表面加入?；?基底膜基質(zhì)。

3.將培養板放置在37℃，30分鐘?，F在可以添加培養基了。細胞也可以培養在這一凝膠的頂部。

細胞復蘇：

   使用細胞復蘇溶液在冰上 7 小時(shí)內解聚?；锘啄せ|(zhì)能夠實(shí)現將生長(cháng)在?；锘啄せ|(zhì)上的細胞最有效地復蘇，或者使用中性蛋白酶，考慮到連續培養，中性蛋白酶作為一種金屬酶可以分散細胞。

應用操作說(shuō)明

   以下以以誘導多能干細胞培養為例來(lái)進(jìn)行?；锔杉毎鹋苹|(zhì)膠的應用實(shí)驗操作說(shuō)明。

 一、培養材料

1、試劑：?；锔杉毎鹋苹|(zhì)膠(貨號082777/0827775/082777T)；ROCK 抑制劑(Y-27632)；DMEM F12/DMEM；mTeSR1/E8 培養基；Accutase 解離劑、PBS(D-PBS)

2、耗材：無(wú)菌槍頭、六孔板、無(wú)菌 EP 管。

二、培養準備

1、材料預冷:

a、將?；锔杉毎鹋苹|(zhì)膠置于冰盒中，放入 4℃冰箱，使膠能過(guò)夜緩慢融化;

b、4℃預冷無(wú)菌離心管、無(wú)菌槍頭、六孔板、DMEM F12/DMEM；

2、將干細胞金牌基質(zhì)膠以1:80或1:100比例進(jìn)行稀釋?zhuān)?/span>

a.將適量 4℃的 DMEM F12/DMEM 移入冷卻的 15/50 mL EP 中；

b、使用移液器將預冷的槍頭從 EP 管吸取 DMEM F12/DMEM 中移入分裝好的干細胞金牌基質(zhì)膠，再吸取轉移至 EP 管內；重復幾次，直到基質(zhì)膠完全移入到 EP 管中。

c、按比例混合后作為儲備基質(zhì)膠混合液，進(jìn)行后續鋪板;

3、制作基質(zhì)膠涂層

a、按 1mL/孔將基質(zhì)膠混合液加入預冷的六孔板中，輕輕晃動(dòng)以確?；旌弦壕鶆蜾佋诎迳?

b、將 6孔板轉移到 37℃孵育過(guò)夜(板材可以在孵育一小時(shí)后即可使用，但過(guò)夜孵育的涂層對細胞培養效果更佳);

c、使用前吸去涂層上方液體。

4、配置 ROCK 抑制劑(Y-27632)工作液:使用無(wú)菌 PBS 將 Y-27632溶解，配置成10mM溶液(1000X)，工作濃度為 10uM;

5、配置含 ROCK 抑制劑 mTeSR1/E8 培養基:將 10mM 溶液加入 mTeSR1/E8 培養基至終濃度為 10uM。

注意:基質(zhì)膠在>4℃時(shí)會(huì )逐漸聚合成膠，請嚴格把控操作溫度，控制操作時(shí)間;稀釋后的基質(zhì)膠混合液同樣需要冰上操作。

三、細胞培養

1、復蘇 iPSC

a.從液氮罐或干冰中取出 ipsc，37℃水域中解凍，解凍應迅速完成;

b.用 75% 酒精消毒凍存管后轉移到超凈臺/生物安全柜;

c.將細胞溶液轉移到新的 15ml EP 管中，用 DMEM F12/DMEM 沖洗凍存管兩次

d.室溫 300g 離心5min(ipsc對于200-300g的轉速都有較好的耐受性,建議使用300g來(lái)最大限度捕捉細胞，標準程序下建議使用 200g)

e.棄上清，用 2mL 含有 ROCK抑制劑的培養基輕柔地重懸iPSC后轉移到用鋪好板的孔中，前后搖動(dòng)使得細胞均勻分布(建議將每瓶細胞 1*106裝在六孔板的一個(gè)孔內使細胞存活率最大化)

f.將六孔板放回 37℃培養箱，(請在細胞被轉移后立即執行，避免細胞中央密度增加)

g.次日撤去 ROCK 抑制劑，即用無(wú)抑制劑的培養基替代含抑制劑的培養基培養細胞。

注意:細胞培養過(guò)程中不提倡使用抗生素，其會(huì )干擾細胞和其分化潛能;培養環(huán)境應與其他細胞隔離，兩次傳代后檢測支原體;DMSO 在室溫下對細胞有毒，復蘇步驟應快速完成。

2、iPSC 傳代

a.將培養上清吸去，用 1mL 的 PBS 清洗后加入 1mL Acuutase

b.轉移到37℃培養箱3分鐘，或在顯微鏡下觀(guān)察直到大部分細胞脫落(若細胞仍然附著(zhù)可將培養板放在手上，另一手輕輕在你的手上拍打使板發(fā)生輕微震動(dòng)從而使細胞脫落);

c.傳代前準備好基質(zhì)膠涂布的六孔板

d.傾斜培養板，將 Accutase 溶液沿培養層表面轉移兩次，分離結塊并轉移到離心管中

e.用 DMEM F12/DMEM 沖洗培養層表面，并與管中的細胞溶液合并(使用 DMEM/F12或用 PBS 洗滌，建議使用至少 5%的培養基，有利于隨后的造粒和附著(zhù));

f.室溫下 300g 離心五分鐘

g.吸去上清，用含有 ROCK 抑制劑的培養基進(jìn)行重懸，

h.將細胞加入到涂層板中，輕輕搖動(dòng)使細胞分布均勻;

i.將培養板放入 37℃培養箱中孵育。

注意:IPSC生長(cháng)為單層后則會(huì )迅速分化并死亡，為了保持生長(cháng)和多能性，需在其長(cháng)滿(mǎn)前進(jìn)行傳代。

3、iPSC細胞凍存

a.準備細胞和解離液，在解離液解離細胞過(guò)程中，將培養基與 10%DMSO 混合，在凍存管上貼好標簽，配置好凍存液(可選 20%血清或血清替代物提高存活率， 也可以使用 90%胎牛血清