D-熒光素專(zhuān)題

原理

D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍應用于整個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是體內活體成像技術(shù)。其作用機制是在A(yíng)TP和熒光素酶的作用下，熒光素（底物）能夠被氧化發(fā)光。當熒光素過(guò)量時(shí)，產(chǎn)生的光量子數與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性（見(jiàn)下圖）。

將攜帶熒光素酶編碼基因（Luc）的質(zhì)粒轉染入細胞后，導入研究動(dòng)物如大、小鼠體內，之后注入熒光素，通過(guò)生物發(fā)光成像技術(shù)（BLI）來(lái)檢測光強度變化，從而實(shí)時(shí)監測疾病發(fā)展狀態(tài)或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對此反應體系的影響，根據生物發(fā)光強度的變化來(lái)指示能量或生命體征。

分類(lèi)

	D-Luciferin, Sodium Salt	D-Luciferin,Potassium Salt	D-Luciferin Firefly, Free Acid
分子式	NaC11H7N2O3S2 · H2O	C11H7N2O3S2 K	C11H8N2O3S2
分子量	320.32 g/mol	318.42 g/mol	280.33 g/mol
外觀(guān)	淡黃色粉末	淡黃色粉末	類(lèi)白色至淺黃色粉末
溶解性	易溶于水（100 mg/ml）	易溶于水（60 mg/ml）	本品難溶于水，除非加入稀堿促進(jìn)其溶解。
純度	99.7%	99.7%	＞99%

使用方法

（1）體外實(shí)驗：

a：儲存液配置：將1 g的熒光素鈉鹽或鉀鹽溶解于33.3 ml水中，制備成30 mg/ml的儲存液?；靹?，0.2μm濾膜過(guò)濾（可吹入惰性氣體，如氮氣，以防止氧化。）-80℃避光保存，一年內有效。

b：使用：①在冰上避光解凍（若是在冰上比較難解凍，可短暫溫浴，并輕柔混勻）。②用培養基以1:200的比例稀釋儲存液為150μg/ml。③去除培養細胞的培養基直至無(wú)殘留。④待圖像分析前，向細胞內添加1×熒光素工作液，然后進(jìn)行圖像分析（或者細胞放在37℃短時(shí)間孵育約5min后檢測可增強信號）

（2）活體成像：

a：工作液配置：①溶解1 g熒光素鉀鹽或鈉鹽于66.6 ml 無(wú)Ca²⁺和Mg²⁺的DPBS中，配置成15 mg/ml的溶液。②混勻，0.2μm濾膜過(guò)濾（可吹入惰性氣體，如氮氣，以防止氧化。）-80℃避光保存，一年內有效。

b：使用：①在冰上避光解凍（若是在冰上比較難解凍，可短暫溫浴，并輕柔混勻）。

②按照動(dòng)物體重150 mg/kg進(jìn)行注射，（例如，20 g重的小鼠需要注射200μl ）

③注射入體內10-20 min（待光信號達到最強穩定平臺期），再進(jìn)行成像分析。

注：建議對每只動(dòng)物模型都需要建立熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，從而確定最高信號檢測時(shí)間和信號平臺期。

注射方法

（1）腹腔注射：

將底物注射入腹腔中。推薦劑量為150 mg/Kg（例如，20 g重的小鼠需要注射200μl ）。使用25 G的針頭，1 ml注射器。

其方法如下示意圖：

進(jìn)針5 mm，斜向上30^°角。

（2）靜脈注射：

小鼠的靜脈注射通常是在小鼠的尾部或者眼眶靜脈注射。靜脈注射的推薦劑量同腹腔注射，150 mg/Kg。注射液體的最大體積不可超過(guò)血容量的10%。一般對于20 g 小鼠其血容量為2 ml，故其最大注射量應為200μl。使用1 ml注射器26 G針頭，或者使用胰島素注射器28 G針頭，確保注射器中無(wú)氣泡。注射前將動(dòng)物置于加熱燈下約5 min，或者將尾巴浸泡于溫水中以擴張血管。操作時(shí)將小鼠固定于鼠筒或者燒杯中，乙醇消毒尾部，緩慢注射。

客戶(hù)實(shí)例

TIPE2抗炎因子在乳腺癌動(dòng)物模型中的抗腫瘤治療作用

選自文獻：Zhang Z, Li L, Cao S, et al. Gene delivery of TIPE2 inhibits breast cancer development and metastasis via CD8 +, T and NK cell-mediated antitumor responses[J]. Molecular Immunology, 2017, 85:230.

FAQ

Q1: 熒光素的純度對實(shí)驗有成影響嗎？

A：有影響。99%以上的純度較好。

Q2: 甲蟲(chóng)熒光素和螢火蟲(chóng)熒光素之間有區別嗎？

A：二者之間沒(méi)有區別。

Q3: 如何溶解熒光素，其溶液穩定嗎？

A：熒光素鉀鹽在水中的溶解度為60 mg/ml，熒光素鈉鹽溶解度為100 mg/ml。熒光素游離酸是不溶于水的，但是在甲醇中的溶解度為10 mg/ml，在DMSO中溶解度為50 mg/ml。

熒光素鈉鹽和鉀鹽的水溶液短期內存放于-80℃，對實(shí)驗效果沒(méi)有明顯影響。有實(shí)驗證明，將熒光素溶解于脫氧中的水中會(huì )更穩定些。

對于一些較為敏感的試驗，為了控制試驗中的可變因素，較推薦新鮮配置的反應液 。例如，低濃度的熒光素酶或者并非最適的反應條件是需要高質(zhì)量的底物才能進(jìn)行反應  。

Q4: 熒光素鈉鹽和熒光素鉀鹽有什么區別？

A：目前的研究沒(méi)有發(fā)現二者在使用效果上的區別，僅在物理特征上有些小的差別，如熒光素鈉鹽溶解度會(huì )高于熒光素鉀鹽。但是在體內實(shí)驗研究中，有更多的研究者傾向于選擇熒光素鉀鹽，據不完全統計，選用鉀鹽的使用人是鈉鹽使用人的3倍。

Q5: 熒光素鈉鹽，熒光素鉀鹽，和熒光素游離酸之間有什么區別？

A：游離酸不溶于水，在甲醇中的溶解度為10 mg/ml，在DMSO中溶解度為50 mg/ml，同樣可用 NaOH，KOH弱堿去調節溶液的PH值。熒光素的鈉鹽或者鉀鹽在使用過(guò)程中會(huì )更方便，尤其是在體內成像實(shí)驗中，因其能夠溶解在水中，反應毒性也會(huì )更小些。

Q6: 為什么溶解熒光素鈉鹽或者鉀鹽的時(shí)候需用不含Ca2+或Mg2+離子的PBS，有無(wú)別的鹽溶液可用來(lái)溶解熒光素？

A：PBS，或者其他的磷酸鹽緩沖液，或DPBS，常用來(lái)進(jìn)行生物學(xué)研究或者細胞相關(guān)研究。PBS/DPBS為等滲溶液，PH為7.2-7.6之間。DPBS和PBS之間無(wú)差別，只是通常情況下，DPBS是不含鈣鎂離子。鈣鎂離子可能會(huì )抑制某些蛋白酶的活性。此外Mg²⁺是催化熒光氧化的重要因素，Ca²⁺是和腔腸素氧化有關(guān)的離子。其他的鹽溶液也可用來(lái)溶解熒光素，但要避免溶液中的陽(yáng)離對實(shí)驗造成影響。

Q7: 熒光素酶的發(fā)光特性？

A：熒光素腹腔注射老鼠后約1 min后，能夠表達熒光素酶的細胞開(kāi)始發(fā)光，10 min后強度達到穩定的最高點(diǎn)，在最高點(diǎn)持續約20-30 min后開(kāi)始衰減，約3 h后熒光素排除，發(fā)光全部消失，最好的檢測時(shí)間是在注射后15-35 min內。其動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)如下圖：

Q8: 怎么將熒光素注入小鼠體內，注射方法之間的區別是什么？

A：熒光素可通過(guò)腹腔注射或尾部靜脈注射注入小鼠體內。約1 min可擴散到小鼠全身。大部分情況下使用熒光素濃度為150 mg/kg。對于20 g的小鼠約使用3 mg的熒光素即可。對于腹腔注射來(lái)講，擴散較慢，開(kāi)始發(fā)光較慢，持續發(fā)光時(shí)間較長(cháng)。對于熒光素的尾部靜脈注射，擴散快，開(kāi)始發(fā)光快，但發(fā)光持續時(shí)間較短。

Q9: 熒光素底物可以透過(guò)血腦屏障嗎？

A：熒光素底物約280道爾頓，熒光素的水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細胞膜和血腦屏障。

Q10: 熒光素酶的表達穩定性如何？

A：通過(guò)穩定篩選等過(guò)程，熒光素酶基因是能夠插到細胞染色體內的。當細胞進(jìn)行分裂、轉移、分化時(shí)，熒光素酶也得到持續穩定的表達，熒光素酶的半衰期約為3 h，故只有活細胞才能持續表達熒光素酶。

注意：建議對每只動(dòng)物模型都需要建立熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，從而確定最高信號檢測時(shí)間和信號平臺期。保存和操作的過(guò)程中都要避光。另外水溶性?xún)Υ嬉哼^(guò)濾除菌后，可以-20℃或-80℃分裝凍存，避免反復凍融。如果有條件，對儲存液充氮氣或氬氣（防止氧化），穩定性和保存時(shí)間更長(cháng)，長(cháng)達1年。 注射方式，動(dòng)物類(lèi)型以及體重等都會(huì )影響信號的發(fā)射，因此建議每次實(shí)驗都要做熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，確定最佳信號平臺期和最佳的檢測時(shí)間。熒光素鉀鹽和熒光素鈉鹽應用上沒(méi)有差別，兩者的差別在于物理性狀上如外形和溶解性。鈉鹽的水溶性高于鉀鹽。從目前發(fā)表的文獻來(lái)看，鉀鹽的使用率遠高于鈉鹽，尤其是體內實(shí)驗。兩者功效相同。 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

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