常規PCR，環(huán)介導的恒溫PCR（LAMP），重組酶聚合酶擴增（RPA）三種分子擴增技術(shù)原理和對比

常規PCR

       PCR即聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction）的縮寫(xiě)，1983年出現的一種對已知DNA片段進(jìn)行體外擴增的技術(shù)。它利用耐高溫的DNA聚合酶（Taq 酶），將模板DNA，引物，脫氧核苷三磷酸（dNTP）和緩沖液等在不同溫度間循環(huán)，從而達到雙鏈DNA分離，引物粘合到模板上的互補區間，最后在DNA聚合酶作用下脫氧核苷三磷酸逐個(gè)添加到新合成的DNA鏈上的過(guò)程。通過(guò)PCR技術(shù)，特定DNA片段可以達到指數級別的擴增，從原來(lái)的少量DNA分子擴增到可以用儀器檢測的水平，利用這一特點(diǎn)可以對一些特異的病原或疾病標志物進(jìn)行診斷。

       近幾年，由于PCR技術(shù)的不斷成熟，特別是實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）的出現，使得基于qPCR的分子診斷產(chǎn)品日漸成為主流。但常規的PCR技術(shù)由于熱循環(huán)的需要，使這一技術(shù)完全依賴(lài)于電源和昂貴的PCR儀器，從而限制了這一技術(shù)在實(shí)驗室之外的應用。由于這些缺點(diǎn)，科學(xué)界一直在試圖發(fā)展不需要使用PCR儀器的核酸擴增方法，恒溫核酸擴增技術(shù)的發(fā)展成為一個(gè)不可逆轉的趨勢。
主要的步驟：
★DNA變性 加熱使靶DNA序列雙鏈解離成單鏈DNA。
★引物與靶DNA退火 適當降低溫度，使兩個(gè)引物分別結合成靶DNA兩條的3′末端向5′末端延伸。
★引物延伸 在DNA聚合酶的催化下，引物沿著(zhù)靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA鏈在變性解離后，又可作為模板與引物雜交，并且在DNA聚合酶的催化下，引導合成新的靶DNA鏈。如此反復進(jìn)行以上3個(gè)步驟，即可使靶DNA片段指數性擴增。

環(huán)介導恒溫核酸擴增（LAMP）
       環(huán)介導恒溫核酸擴增（LAMP）是日本學(xué)者Notomi等在2000年發(fā)表的一種核酸擴增的方法，他利用特殊的引物設計方法和恒溫核酸鏈置換酶將少量目標DNA在60分鐘內擴增到千百萬(wàn)份。LAMP反應中需要4-6個(gè)引物，這些引物特異性的識別模板DNA的6-8個(gè)DNA區間。在每一套LAMP的引物中，包括兩個(gè)外部引物（F3和B3），兩個(gè)內部引物（FIP和BIP）以及兩個(gè)環(huán)導引物（loop F和loop B）。LAMP引物設計和反應原理如圖1所示。

      LAMP的反應混合物由dNTPs，鏈置換聚合酶，熒光染料，引物和DNA模板組成。用于LAMP反應的引物設計，其特征在于使用四種不同的引物，這些引物是專(zhuān)門(mén)設計用于識別靶DNA的六個(gè)不同區域的。前內引物（FIP）由3' 末端的F2區和5' 末端的F1c區組成；正向外引物（F3引物）由F3區組成，其與模板序列的F3c區互補；向后內部引物（BIP）由3' 末端的B2區域和5' 末端的B1c區域組成。向后外引物（B3引物）由B3區組成，其與模板序列的B3c區互補。當FIP的F2區與靶DNA的F2c區雜交并啟動(dòng)互補鏈合成時(shí)，擴增開(kāi)始，然后F3引物與靶DNA的F3c區域雜交并延伸，取代FIP連接的互補鏈。該置換鏈在5' 末端形成環(huán)，這種在5' 末端具有環(huán)的單鏈DNA然后用作BIP的模板，B2與模板DNA的B2c區域雜交，啟動(dòng)DNA合成，導致形成互補鏈并打開(kāi)5' -末端環(huán)，隨后，B3與靶DNA的B3c區域雜交并延伸，置換BIP連接的互補鏈，這導致形成啞鈴形DNA。通過(guò)Bst DNA聚合酶將核苷酸添加到F1的3' 末端，其在5' 末端延伸并打開(kāi)環(huán)，啞鈴形DNA現在轉變?yōu)榍o環(huán)結構（參見(jiàn)a和b）。該結構用作LAMP循環(huán)的引發(fā)劑，其是LAMP反應的第二階段。也可以添加環(huán)引物用于LAMP的指數擴增，獲得的最終產(chǎn)品是具有不同莖長(cháng)度的莖環(huán)DNA和具有多個(gè)環(huán)的各種類(lèi)似于菜花的結構的混合物。

重組酶聚合酶擴增（RPA）

      重組酶聚合酶擴增（RPA），被稱(chēng)為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)。RPA技術(shù)主要依賴(lài)于三種酶：能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應溫度在37℃左右。重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會(huì )發(fā)生鏈交換反應形成并啟動(dòng)DNA合成，對模板上的目標區域進(jìn)行指數式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結合，防止進(jìn)一步替換。在這個(gè)體系中，由兩個(gè)相對的引物起始一個(gè)合成事件（見(jiàn)圖2）。整個(gè)過(guò)程進(jìn)行得非?？?，一般可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產(chǎn)物 （Piepenburg等，2006）。

      RPA不但可以快速擴增，還支持在同一個(gè)管中同時(shí)進(jìn)行多個(gè)擴增反應。不過(guò)，多重化的引物組合需要精心設計，以便每個(gè)引物都能同樣有效的工作。需要注意的是，RPA反應的引物總量（nmol）最好不要超標太多。如果在一個(gè)反應中使用兩個(gè)以上的擴增引物，就應該控制不同引物的量。另外，檢測多個(gè)擴增事件的探針、設備以及熒光物質(zhì)的兼容性都需要提前考慮。RPA還可以對模板進(jìn)行定量。因為擴增產(chǎn)物達到可檢出水平的時(shí)間，是依賴(lài)于反應起始時(shí)的模板量。初始模板的拷貝越多，擴增產(chǎn)物就越快達到可檢出水平。不過(guò)，這種定量需要精心的實(shí)驗安排，確保對照反應是同時(shí)開(kāi)始的。舉例來(lái)說(shuō)，可以利用鎂離子的添加時(shí)間進(jìn)行控制。因為鎂離子一旦進(jìn)入體系，RPA反應就會(huì )開(kāi)始。此外，較慢的擴增過(guò)程有助于更精確的定量。我們可以通過(guò)調整反應條件或引物設計來(lái)減慢RPA的反應速度。目前大多數RPA相關(guān)產(chǎn)品還是由英國的Twist Dx開(kāi)發(fā)的。

重組酶/引物復合物尋找模板DNA的同源序列（紅色/藍色）。鏈交換后，置換的鏈由gp32（綠色）結合，引物通過(guò)Bst聚合酶（藍色）延伸。兩個(gè)引物結合/延伸最終產(chǎn)生一個(gè)完整的擴增拷貝。重復該過(guò)程導DNA指數擴增。（Piepenburg等，2006）