WB內參抗體選擇指南

內參是什么？

內參是一種特異識別高表達或普遍表達蛋白的抗體，在western blot中用于校正蛋白水平。

什么情況下需要用內參抗體?
1. 定量比較：對比不同點(diǎn)樣孔間信號的時(shí)候，內參是必須的。只有各孔間內參的表達量相同，目標蛋白表達量的變化才是可信的。
2. 上樣和轉移確認：內參可以確認是否所有的樣品都加入及各孔間的轉移量是否相等。通過(guò)分析內參信號可以確定蛋白從膠轉移到膜上是否均一。
3. 研究發(fā)表：大部分雜志要求做WB實(shí)驗時(shí)提供內參數據，來(lái)確保實(shí)驗樣本中差異表達量是可信的。內參可以校正各孔間目的蛋白的表達量。

在內參抗體的選擇過(guò)程中一般遵循以下原則：

首先要考慮的就是實(shí)驗樣本來(lái)源于什么物種。
1、哺乳動(dòng)物的組織或者細胞樣本，通常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,K -ATPase等。
2、植物來(lái)源實(shí)驗樣本，則可以選擇plant actin、Rubisco等。
3、其他來(lái)源樣本研究較少，所以就應該參照文獻報導，選擇合適的蛋白作為內參。

蛋白分子量
選擇內參抗體時(shí)，應該考慮目的蛋白分子量的大小。通常應該保證目的蛋白與內參蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子45KD，此時(shí)不適宜選擇β-actin作為內參，可以考慮選擇GAPDH或者β-tubulin作為內參。

目的蛋白表達部位
就一般的蛋白檢測來(lái)說(shuō)，β-actin、β-Tubulin抗體等就可以了，而針對于核蛋白的定量，特別是樣本蛋白就是核蛋白時(shí)，選擇恰當的核蛋白內參則更能體現內部參照的價(jià)值。
常用的核內參抗體有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常見(jiàn)的核蛋白內參還有PCNA、K70、K80等，在一些文獻報道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。
而對于膜蛋白檢測，常用的內參抗體為Na,K ATPase。
對于線(xiàn)粒體蛋白的檢測，常用VDAC1和COX IV作為內參抗體。
以上幾條原則只是針對通常情況，但是需要注意的問(wèn)題是——內參的選擇需要考慮實(shí)際的實(shí)驗環(huán)境。
比如某些細胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會(huì )導致GAPDH的表達增高，不適合做內參。
比如在涉及細胞增殖相關(guān)試驗中，c-Jun由于自身表達變化就不適合做內參;而在凋亡實(shí)驗時(shí)，TBP、Lamin等也不適合作為內參。
因此設計實(shí)驗方案的時(shí)候應該考慮這些因素并查詢(xún)相應文獻，在實(shí)驗過(guò)程中也應該注意如果內參表達出現異常，應考慮這方面因素。

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