國產(chǎn)MIRPA替代新一代等溫擴增檢測技術(shù)RPA

近期,頂級學(xué)術(shù)期刊連發(fā)兩篇頂級論文，上半年引爆生物圈的華人科學(xué)家張鋒教授團隊又有新動(dòng)作!這次,他在一月內,分別在《Nature》、《Science》連發(fā)兩篇論文!他將CRISPR-Cas13a改造成了靈敏度達到了阿摩爾級(aM,10的負18次方摩爾每升),可以檢測單分子的SHERLOCK技術(shù)。而這其中,RPA起到了不小的作用。

RPA,即重組酶聚合酶擴增技術(shù),是在由多種酶和蛋白的參與下,在恒溫條件下實(shí)現核酸指數擴增的技術(shù),被稱(chēng)為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)。是英國TwistDx公司開(kāi)發(fā)的，該公司通過(guò)突破等溫DNA擴增，開(kāi)發(fā)的重組酶聚合酶擴增專(zhuān)利技術(shù)（RPA），被譽(yù)為DNA診斷領(lǐng)域的革命性創(chuàng )新。

安普未來(lái)生物科技有限公司經(jīng)過(guò)十年技術(shù)沉淀，以代表未來(lái)技術(shù)趨勢的多酶恒溫快速擴增技術(shù)，MIRA（Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, MIRA）。

MIRA（Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, MIRA）技術(shù)是一種多酶恒溫核酸快速擴增技術(shù)，

基本原理是：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復合體 Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結合蛋白 SSB 的幫助下，侵入雙鏈 DNA 模板；在侵入位點(diǎn)形成 D-loop 區域，并開(kāi)始對 DNA 雙鏈進(jìn)行掃描；待找到與引物互補的目的區域后，復合體 Rec/ssDNA 解體的同時(shí)，聚合酶也結合到引物的 3’末端，開(kāi)始鏈的延伸，這個(gè)過(guò)程迅速高效地循環(huán)，從而完成目的片段超快速擴增。

熒光檢測則依賴(lài)核酸外切酶的作用，加入根據模版設計的特異的分子探針，使用熒光監測設備實(shí)現對目標片段擴增過(guò)程的實(shí)時(shí)監控。

圖 1：MIRA 技術(shù)原理圖示

★引物設計

建議使用長(cháng)度在 30-35bp 的引物，引物過(guò)長(cháng)或過(guò)短會(huì )影響擴增速度和檢測靈敏度（特殊情況下設計較長(cháng)

引物比較困難的序列，引物長(cháng)度可縮短至 25 bp，但最好不少于 25 bp）；引物序列要求：

1.堿基排布隨機性高，GC 含量在 30%-70%之間；

2.擴增片段避免形成二級結構而影響擴增；

3.擴增片段長(cháng)度建議在 150-300 bp，通常不超過(guò) 500 bp。

★熒光探針設計

在上下游引物中間，設計一段長(cháng)度為 46-52nt 與目的片段互補的序列作為熒光探針；探針序列不與特異

性引物識別位點(diǎn)重疊，長(cháng)度為 46-52 nt，序列避免回文序列、內部二級結構和連續的重復堿基。探針共有四

個(gè)修飾位點(diǎn)：

1.距離 5’端的 30-35 nt 的中部位置標記一個(gè) dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸外切酶的識別位點(diǎn) （任

何堿基，無(wú)特殊要求） ；

2.THF 位點(diǎn)的上游的 T 堿基上標記一個(gè)熒光基團（如 FAM），下游在 T 堿基上標記一個(gè)淬滅基團（如

BHQ1），兩個(gè)基團的間距為 2-4 nt；

3.THF 距離 3’末端約 15 nt，并且 3’末端標記一個(gè)修飾基團，例如胺基、磷酸基團或 C3-spacer。

圖 2：MIRA 熒光探針圖示

4.探針示例：

探針序列：

5’-ATGGCTATCATATCGCATAACTGCCGACAGTAGCTCTCAAAGATGGACC-3’

                30-35nt                                ≥15nt

探針修飾：

ATGGCTATCATATCGCATAACTGCCGACAG[FAM-dT]AG[THF][BHQ-dT]CTCAAAGATGGACC-3’C3spacer。

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