PCR替代技術(shù)，RPA全攻略之疑難解答

      重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被稱(chēng)為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)(由英國公司TwistDx Inc開(kāi)發(fā))。以此為基礎的TwistAmp? 核酸擴增產(chǎn)品，能夠在15分鐘內進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測。該技術(shù)對硬件設備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業(yè)等領(lǐng)域。

RPA反應需要在怎樣的溫度下進(jìn)行?
      標準TwistAmp?試劑盒的運行溫度在37°C - 42°C之間。溫度超過(guò)42°C會(huì )使酶的活性受到影響。RPA反應在低于37°C的條件下也能進(jìn)行，不過(guò)TwistAmp?試劑盒已經(jīng)針對反應速度進(jìn)行了優(yōu)化，不一定支持超出范圍的溫度條件。為了獲得更好的效果，TwistDx公司推薦用戶(hù)在40°C下使用于逆轉錄試劑盒。

RPA反應能實(shí)現多重化么?
       可以。RPA技術(shù)支持在同一個(gè)管中同時(shí)進(jìn)行多個(gè)擴增反應。不過(guò)，多重化的引物組合需要精心設計，以便每個(gè)引物都能同樣有效的工作。需要注意的是，RPA反應的引物總量(nmol)最好不要超標太多。如果在一個(gè)反應中使用兩個(gè)以上的擴增引物，就應該控制不同引物的量。另外，我們應當事先考慮好檢測多個(gè)擴增事件的探針、設備以及熒光團的兼容性。

RPA反應需要在特殊儀器上進(jìn)行么?
      不需要。對TwistAmp?基礎試劑盒和nfo試劑盒而言，只要溫度能控制在37-42°C之間就行。進(jìn)行實(shí)時(shí)監控的體系(如TwistAmp? exo試劑盒)，需要能夠激發(fā)和檢測熒光團的恒溫裝置，比如酶標儀或實(shí)時(shí)檢測的熱循環(huán)儀。

RPA反應能對模板進(jìn)行定量么?
      可以。擴增子達到可檢出水平的時(shí)間，依賴(lài)于反應起始時(shí)的模板量。初始模板的拷貝越多，擴增子就越快達到可檢出水平。不過(guò)，這種定量需要精心的實(shí)驗安排，確保對照反應是同時(shí)開(kāi)始的。舉例來(lái)說(shuō)，可以利用鎂離子的添加時(shí)間進(jìn)行控制。因為鎂離子一旦進(jìn)入體系，RPA反應就會(huì )開(kāi)始。
此外，較慢的擴增過(guò)程有助于更精確的定量。我們可以通過(guò)調整反應條件或引物設計來(lái)減慢RPA的反應速度。

擴增產(chǎn)物能在瓊脂糖凝膠上分析么?
      可以，TwistAmp?基礎反應、TwistAmp?nfo和TwistAmp? fpg都可以通過(guò)跑膠進(jìn)行終點(diǎn)分析。不過(guò)TwistAmp? exo不行，因為該系統里的外切核酸酶會(huì )消化擴增子。

擴增反應能進(jìn)行熒光終點(diǎn)分析么?
      可以。這樣比較的是反應開(kāi)始時(shí)的熒光和反應結束時(shí)的熒光，熒光增強意味著(zhù)發(fā)生了擴增。

RPA支持生物素或熒光標記的寡核苷酸么?
      支持。在RPA反應中，連有生物素或熒光團的引物與未修飾的引物表現差不多。據悉還沒(méi)有發(fā)現任何差異。

能用插入性染料實(shí)時(shí)監控RPA么?
可以。插入性染料可以在RPA反應中進(jìn)行定量和監控。不過(guò)，這種染料可以結合任何雙鏈DNA，會(huì )生成來(lái)自引物的假陽(yáng)性信號。由于RPA擴增在常溫下進(jìn)行，這種噪音會(huì )比PCR嚴重一些。此外，不推薦把插入性染料用于TwistAmp? exo體系，因為體系中的核酸外切酶會(huì )在反應過(guò)程中切割擴增產(chǎn)物。

RPA試劑能制成master-mix么?
      可以。在進(jìn)行DNA檢測時(shí)，可以把重懸緩沖液、引物和探針混合在一起，重懸凍干的RPA pellets。然后將不同DNA加入反應體系，最后用MgAc起始反應。在進(jìn)行引物篩選時(shí)，可以用重懸緩沖液、模板DNA、探針和一個(gè)引物制成master-mix，將其分裝到1.5 ml小管之后再分別加入不同的引物。注意：只有當兩個(gè)引物都存在時(shí)，才能重懸凍干的RPA pellets，否則重組過(guò)程就會(huì )有偏向性。

跑膠之前需要回收RPA產(chǎn)物么?
      需要。RPA反應中的物質(zhì)會(huì )干擾瓊脂糖電泳，如果不進(jìn)行產(chǎn)物回收，跑出來(lái)的帶會(huì )出現拖尾。

RPA反應的擴增子能保存么?
       TwistAmp? Basic或nfo的擴增產(chǎn)物可以保存，短期可以放在4°C，保存時(shí)間較長(cháng)的話(huà)建議放在-20°C。
TwistAmp? exo (RT)的擴增產(chǎn)物不能保存。因為擴增停止后如果沒(méi)有及時(shí)失活，外切酶III會(huì )快速消化擴增子。

TwistAmp? 基礎反應的擴增子能進(jìn)行TA克隆么?
      TwistAmp?基礎反應中的聚合酶沒(méi)有編輯功能，擴增子應該是可以用于TA克隆的。不過(guò)TwistDx公司還沒(méi)有針對這項應用進(jìn)行過(guò)測試。

能直接用標記的探針和TwistAmp?基礎試劑盒進(jìn)行側流層析檢測么?
      可以。你可以用兩個(gè)經(jīng)過(guò)修飾的引物來(lái)進(jìn)行側流層析檢測(LFD)。不過(guò)TwistDx公司推薦使用探針和TwistAmp? nfo 試劑盒。這是因為RPA跟PCR差不多，也傾向于形成引物二聚體。如果引物不完美，很容易發(fā)生交叉反應，生成假陽(yáng)性結果。而TwistAmp? nfo體系能夠避免這個(gè)問(wèn)題。

在用側流層析試紙進(jìn)行檢測時(shí)需要稀釋RPA產(chǎn)物么?
      是的。RPA反應中的一些物質(zhì)會(huì )干擾試紙上的抗體，如果不能充分稀釋就會(huì )出現非特異性結合和假陽(yáng)性信號。

在TwistAmp? exo (RT)反應即將結束時(shí)熒光急劇增強，這正常么?
       是正常的。在TwistAmp? exo反應中，聚合酶和核酸外切酶III處于競爭關(guān)系。隨著(zhù)反應的能量逐漸耗盡，核酸外切酶III開(kāi)始占據優(yōu)勢，結果導致熒光信號出現劇增。

文章來(lái)源：http://www.biodiscover.com/news/research/114333.html

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