細胞系的培養與傳代實(shí)驗指南

細胞系的培養與傳代
簡(jiǎn)介（INTRODUCTION）
細胞在培養瓶長(cháng)成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續生長(cháng)，同時(shí)也將細胞數量擴大，須進(jìn)行傳代再培養。傳代培養也是一種將細胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養細胞進(jìn)行各種實(shí)驗的必經(jīng)過(guò)程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。
材料（MATERIALS）
o  試劑（REAGENTS）
    完全培養基（RPML1640或DMEM），胰蛋白酶消化液,1XPBS
o  試劑準備（REAGENT SETUP）
1XPBS:NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4?12H2O 3.63g，KH2PO4 0.24g，溶于900ml；雙蒸水中，用鹽酸調pH值至7.4，加水定容至1L,高溫滅菌后4℃保存,也可配制10XPBS室溫保存；
完全培養基：90%液體培養基+10%小牛血清（特殊需要會(huì )標注在培養基說(shuō)明書(shū)上）；
胰蛋白酶消化液：0.25g的胰蛋白酶和0.02g的EDTA加入1XPBS，終體積為100ml，pH7.4，0.22um濾過(guò)除菌分裝，4℃保存。
o  器械（EQUIPMENT）
EP管、15ml離心管、離心機、細胞培養箱
實(shí)驗步驟（PROCEDURE）
貼壁細胞傳代與培養 ?預期時(shí)間消耗：30min
1.  倒置顯微鏡下觀(guān)察細胞形態(tài)，確定細胞是否需要傳代，并將培養基與PBS置于37℃水浴，
胰酶消化液室溫放置，點(diǎn)燃酒精燈，將所需試劑擺放到相應位置；
2．用1ml槍頭棄去培養皿中上清液，加入3ml 1XPBS洗滌兩遍，加入胰酶消化液1ml，輕輕搖晃后放于細胞培養箱中1min（可酌情增加時(shí)長(cháng)），可以放在倒置顯微鏡下觀(guān)察，當細胞收回突起變圓即可；
3．加入6ml培養基并吹打培養皿底，將細胞移入離心管中，1000rpm 3min離心；
4．棄上清，加入1ml培養基吹打均勻，用細胞計數板計數后取需要的細胞數量加入到新的培養基中，搖晃均勻；
5．放置培養箱中培養，可以每天觀(guān)察，期間如果細胞培養基營(yíng)養不夠可更換成新鮮培養基。
▲關(guān)鍵步驟：控制好消化時(shí)間，有些貼壁細胞貼壁較緊，需要確保吹打均勻。
懸浮細胞傳代與培養 ?預期時(shí)間消耗：30min
1．倒置顯微鏡下觀(guān)察細胞形態(tài)，確定細胞是否需要傳代，并將培養基與PBS置于37℃水浴，胰酶消化液室溫放置
2．點(diǎn)燃酒精燈，將所需試劑擺放到相應位置
3．將培養皿中培養基移入15ml離心管中，800rpm離心5min
4．棄上清，用2ml 1XPBS洗滌兩次，每次800rpm離心5min
5．加入1ml完全培養基，細胞計數后取需要的細胞數量加入到新的培養基中，搖晃均勻
▲關(guān)鍵步驟：吹打細胞需要輕柔，并且混合均勻。
針對性建議（TROUBLESHOOTING）
細胞培養條件會(huì )根據不同細胞要求不同，以下是總結的條件：
1. 293：人腎上皮細胞， 10%FBS DMEM，從培養皿板底吹下傳代；
2. BHK‐21：幼地鼠腎細胞， 10%FBS DMEM，胰酶消化傳代；
3. NK92：人的 NK 細胞系（懸浮細胞系）， 12.5%FBS +12.5%horseserum α‐mem， 100U/ml 的 IL‐2；
4. MCF‐7：人乳腺癌細胞， 10%FBS DMEM， PBS 沖洗兩次胰酶消化傳代；
5. L929： 1:3 傳代，擴大培養去上清。長(cháng)滿(mǎn)后取走上清，換新鮮培養基，過(guò) 2,3 天可以取用，一共可以取兩批；
6. HT‐29：結腸癌細胞。 10%FBS DMEM， PBS 沖洗兩次胰酶消化傳代；
7. 293T： 10%FBS DMEM，從培養皿板底吹下傳代；
8. DC2.4： 10%FBS DMEM，胰酶消化傳代；
9. Hela: 人宮頸癌細胞。 10%FBS DMEM， PBS 沖洗兩次胰酶消化傳代。 2ml 長(cháng)三天滿(mǎn)；
10. Thp1: 10%FBS 1640 培養， 3 天一代，細胞長(cháng)過(guò)影響狀態(tài)，小瓶留 2ml 傳代，大瓶留 7ml 傳代；  
11. HepG2:人肝癌細胞系。 10%FBS DMEM， PBS 沖洗兩次胰酶消化傳代；
12. LO2: 正常 10%FBS DMEM， PBS 沖洗兩次胰酶消化傳代；
13. Huh 7: 人肝癌細胞系。 10%FBS DMEM， PBS 沖洗兩次胰酶消化傳代；
14. Hepa1‐6(mice liver cancer cells): 10%FBS DMEM， PBS 沖洗兩次胰酶消化傳代；
15. NCTC 1149(mice liver cells): 10% horse serum DMEM， PBS 沖洗。

       沃博生物代理的NEWZERUM新西蘭品牌血清品牌具有百年歷史，血源來(lái)源新西蘭和澳大利亞具有出口資質(zhì)的屠宰場(chǎng)，最大單批次量可達 2000L,確保同一批次質(zhì)量同時(shí)提供充足的血清供應七次無(wú)菌過(guò)濾，最后三次為0.1 μm無(wú)菌過(guò)濾處理，進(jìn)行細菌、真菌、支原體、病毒及病毒抗體檢測，符合國際動(dòng)物協(xié)會(huì )要求。

產(chǎn)品詳情

產(chǎn)品名稱(chēng)	貨號	規格	目錄價(jià)格
特級胎牛血清	FBS-P500	500ML	6000
特級胎牛血清	FBS-P100	100ML	1200

描述：
       內毒素含量極低 <5EU/ml(國際規定：特級胎牛血清<10 EU/ml)
       極利于細胞的生長(cháng)和傳代 ，適合各種細胞培養
       每個(gè)批號血清均具有完整的檢驗報告
       七次無(wú)菌過(guò)濾，最后三次為0.1 μm無(wú)菌過(guò)濾處理
       進(jìn)行細菌、真菌、支原體、病毒及病毒抗體檢測，符合國際動(dòng)物協(xié)會(huì )要求
       每個(gè)批號血清庫存量達500-1000升，保證供應充足
特點(diǎn)：
       極低內毒素，支持各類(lèi)難養細胞;
       同批號跟蹤發(fā)貨，確保實(shí)驗數據連續穩定;
       海外廠(chǎng)家直供，市場(chǎng)價(jià)格透明;
       十年誠懇信譽(yù)，溫暖售后保證!
建議使用范圍：
      科研使用; 細胞培養

推薦血清融化方法：

操作	溫度	100ml	500ml	1000ml
第一步	室溫	35 min	90 min	100 min
	15—20℃水浴	5 min	18 min	20 min
第二步	20℃水浴	15 min	25 min	30 min
第三步	37℃水浴	20 min	35 min	45 min

注意：
? 在水浴過(guò)程中，血清的平面要完全浸在水中。在融化過(guò)程中要慢慢搖動(dòng)，使血清混勻，但不要產(chǎn)生泡沫!
?胎牛血清不推薦熱滅活。
儲存：
       -20°C凍存，4°C保存不超過(guò)1個(gè)月。反復凍融會(huì )破壞血清中有效成分，影響血清品質(zhì)。

相關(guān)產(chǎn)品

產(chǎn)品名稱(chēng)	貨號	規格	目錄價(jià)格
優(yōu)級胎牛血清	FBS-E500	500ML	2500
優(yōu)級胎牛血清	FBS-E100	100ML	1200
碳吸附胎牛血清	FBS-CA500	500ML	詢(xún)價(jià)
碳吸附胎牛血清	FBS-CA100	100ML	詢(xún)價(jià)
透析型胎牛血清	FBS-DI500	500ML	詢(xún)價(jià)
透析型胎牛血清	FBS-DI100	100ML	詢(xún)價(jià)
干細胞胎牛血清	FBS-ES500	500ML	詢(xún)價(jià)
干細胞胎牛血清	FBS-ES500	100ML	詢(xún)價(jià)