解決免疫共沉淀（Co-IP）中的抗體輕重鏈污染問(wèn)題

1.    免疫共沉淀-互作研究經(jīng)典方法

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白間相互作用的經(jīng)典方法，常用于發(fā)現蛋白的互作網(wǎng)絡(luò )、鑒定兩蛋白的互作關(guān)系。

CoIP的設計原理是，假設一種已知蛋白是某個(gè)大的蛋白復合物的組成成員，那么利用這種蛋白的特異性抗體，就可以將整個(gè)蛋白復合物從溶液中“拉”下來(lái)（常說(shuō)的“pull-down”），進(jìn)而可以用于鑒定這個(gè)蛋白復合物中的其他未知成員。

CoIP的特點(diǎn)可以概括為兩點(diǎn)，第一是天然狀態(tài)蛋白，第二是蛋白復合物。

大致流程如下圖所示：

2.哪有那么簡(jiǎn)單

上面講了原理和流程，看起來(lái)很好理解。但研究中往往不像理論那么順利。

在做CoIP實(shí)驗過(guò)程中往往會(huì )遇到目的蛋白與抗體輕鏈（25kDa左右）或者抗體重鏈（55kDa左右）的分子量接近的情況，導致IP-WB檢測時(shí)無(wú)法判斷目的蛋白條帶（如上圖）。

如何解決這種問(wèn)題，困擾了非常多的小伙伴。

3. 問(wèn)題的根源

其實(shí)產(chǎn)生抗體輕、重鏈條帶污染的主要原因是，我們上二抗的時(shí)候，PVDF膜上有兩種一抗：

（1）用于CoIP的一抗脫落后跑電泳并轉印到膜上（上圖紅圈所示）

（2）IP-WB時(shí)加入的一抗（上圖紅色箭頭對應的一抗）。

二抗同時(shí)識別上面兩種一抗，導致除了目標條帶（紅色箭頭）外，還產(chǎn)生抗體的輕鏈和重鏈條帶（黑色箭頭）。

4. 解法

要解決該問(wèn)題主要就是處理掉圖中的輕、重鏈條帶。

那我們知道做WB要有條帶需要2個(gè)要素：目標蛋白、抗體及發(fā)光基團。

解法就是分別解決這3個(gè)要素，任意一個(gè)要素解決了問(wèn)題就解決了。

1)  Co-IP抗體共價(jià)偶聯(lián)到磁珠或者Agarose上——這樣在洗脫的時(shí)候，抗體就不會(huì )被洗到CoIP產(chǎn)物中去。

（產(chǎn)品推薦：A10003 NHS-Activated Magarose Beads，或者M2001X系列Tag-Agarose beads產(chǎn)品）；

 2)  IP-WB檢測一抗直接標記HRP，WB實(shí)驗過(guò)程中不使用二抗——這樣就不會(huì )發(fā)生二抗識別CoIP產(chǎn)物中一抗抗體。

（產(chǎn)品推薦：M200系列HRP標記標簽抗體）；

 3)  使用一款只識別天然構象抗體的二抗——由于WB過(guò)程中，CoIP產(chǎn)物中一抗抗體變性，該二抗不會(huì )識別產(chǎn)生條帶。

（產(chǎn)品推薦：AbSmart系列二抗）；

上述3種方法中：購買(mǎi)共價(jià)偶聯(lián)好的Tag-Agarose beads或者HRP標記的標簽抗體，使用起來(lái)很方便，作為實(shí)驗首選。

但是絕大多數一抗是沒(méi)有HRP標記的或者共價(jià)偶聯(lián)beads的，所以很多實(shí)驗室在做內源性蛋白Co-IP實(shí)驗時(shí)就會(huì )很煩惱，這時(shí)候使用避免抗體輕重鏈的AbSmart系列二抗，就可以有效地解決這類(lèi)問(wèn)題，作為內源性蛋白的Co-IP實(shí)驗的首選。

另外如果Co-IP之后，需要質(zhì)譜鑒定互作蛋白或修飾時(shí)，為了排除質(zhì)譜檢測時(shí)抗體的干擾，可以選擇使用NHS- Activated Magarose Beads來(lái)共價(jià)偶聯(lián)一抗，然后做CoIP實(shí)驗將產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測，這樣可以大大提高質(zhì)譜檢出蛋白的數量和修飾位點(diǎn)的靈敏度。

下面給大家分享一個(gè)實(shí)驗結果案例：

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1.Tag-Agarose beads產(chǎn)品

M20012:Anti-Myc-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

M20013:Anti-HA-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

M20014:Anti-GFP-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

M20018:Anti-DYKDDDDK-Tag Mouse Antibody(Agarose Conjugated)

2.HRP標記的tag產(chǎn)品

M20019: Anti-Myc-Tag Antibody (HRP Conjugated)

M20020: Anti-His-Tag Antibody (HRP Conjugated)

M20021: Anti-Ha-Tag Antibody (HRP Conjugated)

M20022: Anti-GFP-Tag Antibody(HRP Conjugated) 

M20025: Anti-GST-Tag Antibody(HRPConjugated) 

M20026: Anti-DYKDDDDK-Tag Antibody(HRPConjugated) 

3.避免抗體輕重鏈二抗產(chǎn)品

AbSmart-M21004:Goat Anti-Mouse IgG HRP(避免重鏈)

AbSmart-M21005: GoatAnti-Mouse IgG HRP(避免輕鏈)

AbSmart-M21006: GoatAnti-Rabbit IgG HRP(避免重鏈)

AbSmart-M21007: GoatAnti-Rabbit IgG HRP(避免輕鏈)

4.共價(jià)偶聯(lián)Agarose產(chǎn)品

A10003: NHS- ActivatedMagarose Beads

注意：

有同學(xué)反饋說(shuō)使用共價(jià)偶聯(lián)好的Tag-Agarose beads產(chǎn)品，在做CoIP-WB檢測的時(shí)候，也會(huì )出現抗體輕重鏈。

詳細了解實(shí)驗流程后，發(fā)現是由于CoIP實(shí)驗的最后一步（互作蛋白洗脫步驟）操作錯誤導致。

即很多同學(xué)在3次PBST洗滌之后，直接就加入WB Loading buffer進(jìn)行煮樣，然后就進(jìn)行SDS-PAGE上樣了。這樣操作會(huì )導致共價(jià)偶聯(lián)的抗體被分離下來(lái)，在WB中出現抗體輕重鏈的條帶。

正確的操作應該是：1. 3次PBST洗滌之后，加入50-100ul的PH2.5-3.0的甘氨酸溶液（加入體積根據實(shí)驗需求自行調整）；2. 震蕩混勻，靜置30-60s，離心取上清（磁珠用磁力架）；3. 上清中按照體積比1:10（中和液/甘氨酸）加入中和液（中和液為PH9.0的Tris溶液）；4. 后續在上清液中正常加入WB Loading buffer操作即可。

為了方便大家實(shí)驗操作，Abmart為大家提供了配置好的洗脫液和中和液產(chǎn)品（貨號T10007），該產(chǎn)品也可以作為ProA/G產(chǎn)品的洗脫液和中和液。如果是使用Flag抗體進(jìn)行CoIP實(shí)驗，可以使用3*DDDDK多肽（貨號T10004）進(jìn)行洗脫，該產(chǎn)品針對非共價(jià)偶聯(lián)的Flag抗體進(jìn)行的CoIP實(shí)驗，一樣可以起到避免抗體輕重鏈污染的問(wèn)題。