Western blot的實(shí)驗技巧

       Western blot實(shí)驗看似簡(jiǎn)單，但流程又很繁瑣。很多同學(xué)往往做了很長(cháng)時(shí)間的實(shí)驗之后，卻得不到理想的實(shí)驗結果，甚是苦惱。其實(shí)，Western blot實(shí)驗是有很多注意點(diǎn)和實(shí)驗技巧的，小編今天給大家整理了一些非常關(guān)鍵的實(shí)驗事項：

蛋白提取

蛋白提取是實(shí)驗的第一步，也是最重要的一步，很多實(shí)驗結果不好往往是由于蛋白提取出現了問(wèn)題（但是很多同學(xué)卻忽視了蛋白提取質(zhì)量對實(shí)驗結果的重要性）。以下幾個(gè)因素是經(jīng)常導致WB結果不理想的原因：

★ 蛋白提取的裂解液中，目的蛋白含量太低

一些蛋白在組織中的蛋白含量很低（例如轉錄因子等核蛋白，GPCR、CD分子等膜蛋白），如果提取蛋白的時(shí)候沒(méi)有做到富集，往往后續WB顯色的時(shí)候會(huì )導致背景很臟，甚至導致白板的出現。這時(shí)候需要專(zhuān)門(mén)的蛋白富集提取方法來(lái)提取蛋白，例如相對于全細胞或全組織裂解物來(lái)說(shuō)，核表達蛋白在細胞核裂解物總蛋白中占有相當大的比例，這樣凝膠條帶中可以載入更多的目的蛋白。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是排除了雜質(zhì)成分潛在的交叉反應。濃縮使信號最大化（例如檢測核蛋白要用核裂解物）。

如上圖結果所示，使用特定的蛋白提取試劑盒提取蛋白，可以有效的富集特定細胞組分，保證目的蛋白的上樣量。

注：實(shí)驗中使用GAPDH(M20006)分析細胞漿蛋白提取物，使用ATPase(T40109)分析細胞膜蛋白提取物，使用Histone(P30266)分析細胞核蛋白提取物。

膜蛋白產(chǎn)品提取試劑盒貨號：A10008，核蛋白產(chǎn)品提取試劑盒貨號：A10009

★ 蛋白提取后出現降解

在蛋白質(zhì)的提取過(guò)程中，蛋白酶在細胞或組織裂解后釋放，降解蛋白質(zhì)樣品，從而降低蛋白質(zhì)樣品的量。這樣往往導致后續實(shí)驗中檢測不到目的蛋白或蛋白降解帶明顯出現。為防止蛋白質(zhì)被蛋白酶所降解，要加入特異性的蛋白酶抑制劑來(lái)抑制蛋白酶活性。很多同學(xué)在實(shí)驗過(guò)程中也加入了蛋白酶抑制劑，但是為什么還會(huì )出現蛋白降解呢？主要原因是很多同學(xué)往往只加入了一種蛋白酶的抑制劑，但是蛋白酶是有非常多種類(lèi)的，每一種蛋白酶均需要一種特定的蛋白酶抑制劑來(lái)抑制其蛋白酶活性。所以為了防止蛋白降解，需要加入各種蛋白酶抑制劑。

最方便的做法是購買(mǎi)現成的Cocktail形式的蛋白酶抑制劑，這種蛋白酶抑制劑是將常用的數種蛋白酶抑制劑混合到一起，制備成了即用型的試劑產(chǎn)品，用起來(lái)很是方便。

Abmart提供了一款Cocktail形式的蛋白酶抑制劑，可以有效地防止蛋白提取過(guò)程中的蛋白降解問(wèn)題。A10004，200X 蛋白酶抑制劑復合物（200X Protease InhibitorCocktail）【同Sigma P1860】。

電泳轉膜

對于較大分子量的蛋白（大于100 kDa），電泳轉膜這個(gè)步驟是很容易出現問(wèn)題的，主要是包括以下幾個(gè)方面：

1. 對于大蛋白而言，其在凝膠電泳分離遷移較慢，而從凝膠轉出也非常慢，因此對于這種大分子量蛋白應該用低濃度的凝膠，8% 或更低，但因低濃度的膠非常易碎，所以操作時(shí)需十分小心。

2. 大蛋白易在凝膠里形成沉淀，從而影響轉膜。轉膜時(shí)在電轉移緩沖液加入SDS 至終濃度0.1%，避免出現這種情況。甲醇易使SDS 從蛋白上脫失，因此相應降低甲醇的濃度至10% 或更低，以防止蛋白沉淀。

3. 降低電轉移緩沖液中甲醇的比例，這樣可以促進(jìn)凝膠的膨脹，更易于大蛋白的轉出。

4. 只有使用硝酸纖維素膜時(shí)，甲醇才是必需的。如果是PVDF膜，甲醇可以不必加入電轉移緩沖液中，但轉膜前PVDF 需用甲醇活化。

5. 選擇濕式，4℃ 轉膜過(guò)夜，以取代半干式轉膜。

這里，同學(xué)們需要注意：很多同學(xué)習慣使用預染marker判斷轉膜是否成功。該方法很是便捷，但是卻無(wú)法判斷每個(gè)泳道的轉膜情況和是否有氣泡污染。所以最好方法是使用“麗春紅染色QC轉膜質(zhì)量”。

為檢測轉膜是否成功，用TBST 洗膜，然后用麗春紅染色，室溫下震蕩5分鐘。然后將膜浸泡在水中直至水變清且出現蛋白條帶。觀(guān)察膜上的條帶是否清晰，各分子量條帶均可見(jiàn)，無(wú)明顯白色空斑（氣泡導致）。

用TBST 或水重復洗膜直至膜完全脫色，PVDF 膜需用甲醇活化后再用TBST 洗，然后進(jìn)行后續實(shí)驗操作。

10*麗春紅貯備液：2% 麗春紅S 溶于30% 三氯乙酸和30% 磺基水楊酸，震搖混勻。（或者購買(mǎi)現成的10*麗春紅貯備液，貨號: A10010）

一抗孵育/二抗孵育

★ 一抗稀釋液

為防止實(shí)驗結果的背景比較臟，最好使用封閉液來(lái)稀釋一抗，這樣可以避免一抗可能與封閉液有交叉反應。

★ 使用錯二抗

有些抗體是小鼠抗體，有些抗體是兔子抗體，均需要使用對應的二抗來(lái)顯色，用錯了就會(huì )導致白板。特別是很多時(shí)候希望一抗和內參抗體同時(shí)孵育，使得目的蛋白檢測和內參調平一步到位。但是很多時(shí)候是一抗是兔多抗，內參是小鼠單抗，一旦大意疏忽，就會(huì )導致實(shí)驗出錯。

Abmart推出了一款“防錯二抗”（鼠兔通用二抗），一管抗體解決所有問(wèn)題，讓實(shí)驗變得很輕松。

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