共培養遷移實(shí)驗--周細胞與肺微血管內皮細胞共培養遷移試驗

      周細胞生長(cháng)在血管內皮細胞外周，能夠輔助血管的成熟。周細胞的缺失能夠直接影響血管的形成。但在肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension (PAH)）患者肺組織內的內皮細胞與周細胞之間的關(guān)聯(lián)而導致的血管損傷的機理卻尚未清楚。

      斯坦福的科研人員在研究周細胞（pericytes）和肺血管內皮細胞（PMVECs）關(guān)系時(shí)，希望能觀(guān)測到周細胞和PMVECs共培養時(shí)，周細胞收到PMVECs細胞的影響而產(chǎn)生的遷移和極化行為。但在傳統的實(shí)驗中，研究人員只能發(fā)現周細胞對PMVEC細胞有一趨化行為。但是無(wú)法量化這一趨化行為，也無(wú)法研究周細胞的極性變化。

SUMOylation of TARBP2 regulates miRNA/siRNA efficiency.

Chen C, Zhu C, Huang J, Zhao X, Deng R, Zhang H, Dou J, Chen Q, Xu M, Yuan H, Wang Y, Yu J.

Nat Commun. 2015 Nov 19;6:8899. doi: 10.1038/ncomms9899

在文中，研究人員使用Ibidi開(kāi)發(fā)的傷口愈合插件進(jìn)行了這一共培養“傷口愈合”實(shí)驗。這是一種雙孔的硅膠插件，可以放在培養皿中，插件兩孔間的孔壁寬度為500μm。將兩種細胞分別種在插件的兩個(gè)孔中，等待細胞貼壁長(cháng)滿(mǎn)后，將插件移除，這樣，兩孔間的縫隙就是一個(gè)無(wú)細胞的“劃痕”。不僅能夠觀(guān)測到周細胞向內皮細胞遷移的行為，而且可以使用細胞免疫熒光染色的方法，對周細胞內的細胞骨架排列進(jìn)行觀(guān)測，確定細胞的一個(gè)趨化行為。

一、實(shí)驗材料

1) 細胞：PMVECs   （C-12282，PromoCell）Pericyte

2) 實(shí)驗耗材：傷口愈合插件培養皿 (ibidi, 81176)

3) 細胞培養基：

EC-media   （C-22120， PromoCell）

Pericyte media （ScienCell Research Laboratories）

4) 滅菌鑷子

5) 試劑：

中性粒周蛋白   

鬼筆環(huán)肽       

二、實(shí)驗步驟

1）鋪細胞（圖二）

將ibidi傷口愈合培養皿底部的保護膠帶撕除。

在ibidi細胞插件的每孔中分別加入1.5 ×10⁴的PMVECs和Pericyte的細胞懸液。注意不要大力晃動(dòng)培養皿。以防止細胞不均勻。

在37。C培養箱中孵育。

圖二，ibidi傷口愈合插件中加入細胞

2）形成“劃痕”

采用無(wú)血清培養基饑餓細胞16小時(shí)

如圖四所示，小心的用鑷子夾住插件的一個(gè)角，將插件移除。

圖三，移除插件

移除插件后，要用顯微鏡檢查是否形成合格的“劃痕”。

小心的清洗細胞，之后加入2ml培養基進(jìn)行培養（圖四）

 三、采集并分析圖像

在顯微鏡下選取能同時(shí)看到“劃痕”和兩邊細胞的視野進(jìn)行成像，“劃痕”的方向最好是水平或者垂直。

采集0h和6h的圖像，觀(guān)測細胞的遷移率和細胞遷移方向

用中性粒周蛋白定位微管生長(cháng)中心（MTOC）并用鬼筆環(huán)肽標記F-actin

由圖可見(jiàn)，相對于左側的對照，右邊的PAH來(lái)源的Pericytes遷移距離較短，并且從熒光標記圖上可見(jiàn)，紅色箭頭表示遷移的方向，PAH組無(wú)特定方向，不受PMVEC的影響。柱狀圖為統計結果。