腺相關(guān)病毒(AAV)具有無(wú)致病性、高效的長(cháng)期基因表達、易于基因操作以及免疫反應低(或在許多情況下缺乏)的特點(diǎn)，這一系列特性使其成為用于基因治療遞送的重要載體。然而，AAV制造過(guò)程復雜，限制因素多，已成為整個(gè)行業(yè)的瓶頸。

      由于存在圍繞貼壁培養放大的復雜性和勞動(dòng)密集型問(wèn)題，因此一些公司在策略上決定使用懸浮培養而不是貼壁培養來(lái)生產(chǎn)病毒載體。

由貼壁培養過(guò)渡到放大規模的懸浮培養的過(guò)程需要適應細胞，這可能需要幾個(gè)月的時(shí)間，而且并不總是成功。這個(gè)過(guò)程可能會(huì )導致生產(chǎn)力下降、生長(cháng)速度降低以及潛在的遺傳不穩定，細胞基因表達模式的改變也很常見(jiàn)。在這種情況下，盡早使用懸浮培養生產(chǎn)病毒載體的策略，有望大大簡(jiǎn)化工業(yè)化的大規模生產(chǎn)。

      值得注意的是，大規模生產(chǎn)工藝是保證高產(chǎn)量和可靠的AAV病毒載體商業(yè)化制造過(guò)程的關(guān)鍵，這依賴(lài)于穩健的大規模瞬時(shí)轉染過(guò)程。專(zhuān)業(yè)且富有實(shí)戰經(jīng)驗的轉染試劑供應商可以為高效穩健的轉染過(guò)程提供重要支持，Polyplus-transfection是第一家面向基因和細胞治療市場(chǎng)的GMP轉染試劑供應商，也是唯一一家從最初的工藝開(kāi)發(fā)到商業(yè)化向病毒制造商提供廣泛的技術(shù)和監管支持的轉染試劑供應商。2018年，該公司推出了首個(gè)用于生產(chǎn)治療性病毒的GMP兼容轉染試劑（PEIpro-GMP）。

      近期，Polyplus-transfection公司推出了一款基于化學(xué)成分且不含動(dòng)物源的陽(yáng)離子納米技術(shù)的轉染試劑FectoVIR-AAV，專(zhuān)為懸浮細胞體系規?；a(chǎn)AAV而開(kāi)發(fā)，可用在基因和細胞治療領(lǐng)域。

      FectoVIR-AAV適用于各種規格的搖瓶、轉瓶、細胞培養袋和生物反應器中無(wú)血清懸浮培養的DNA轉染，且兼容在細胞培養過(guò)程中抗生素的使用。

      FectoVIR-AAV可以解決現有轉染試劑在AAV生產(chǎn)過(guò)程中的局限性，以下部分將展開(kāi)描述現有挑戰，以及FectoVIR-AAV對比其他轉染試劑的優(yōu)勢。

高性能：懸浮培養系統中rAAV的高產(chǎn)量

      FectoVIR-AAV轉染試劑是一種新型的基于化學(xué)物質(zhì)的不含動(dòng)物成分的轉染試劑，其設計目的是解決當前rAAV病毒載體產(chǎn)量和工業(yè)可擴展性方面的限制。

與PEIpro轉染試劑和其他競品相比，FectoVIR-AAV轉染試劑在懸浮細胞培養系統中生產(chǎn)rAAV病毒載體方面表現出高性能。FectoVIR-AAV可重復性地大幅提高AAV的產(chǎn)量，與其他競品(PEImax)相比，增幅高達10倍(如下圖)。

▲ 與競品相比，FectoVIR-AAV可提高病毒基因組的生產(chǎn)效率和包裝效率，從而使功能性rAAV-2-GFP的產(chǎn)量提高10倍。

      可擴展性：專(zhuān)為小規模到大規模生產(chǎn)而開(kāi)發(fā)

可擴展性是保證高產(chǎn)量和可靠的rAAV病毒載體生產(chǎn)過(guò)程商業(yè)化的必要條件。大規模rAAV病毒載體的制造依賴(lài)于一個(gè)穩健的大規模瞬時(shí)轉染過(guò)程。大規模瞬態(tài)轉染意味著(zhù)需要在給定的時(shí)間框架內制備大量轉染復合物并將其添加到懸浮液細胞中，以便高效轉染。FectoVIR-AAV專(zhuān)門(mén)用于大規模轉染，可以解決AAV制造過(guò)程中體積和時(shí)間限制方面的局限性。

轉染復合物體積：

      通常，轉染復合體積占最終細胞培養體積的10％，這在擴大生產(chǎn)規模時(shí)可能會(huì )導致技術(shù)限制。FectoVIR-AAV經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可將絡(luò )合量降低至1％，從而有助于制備用于大規模生產(chǎn)的轉染復合物。例如，對于200 L的細胞懸液體積，轉染復合體積可以從20 L (10％)降至2 L (1％)進(jìn)行優(yōu)化。

▲ 優(yōu)化的FectoVIR-AAV轉染復合物制劑，可進(jìn)行大規模瞬時(shí)轉染。

轉染孵育時(shí)間：

      大規模瞬時(shí)轉染需要向懸浮細胞培養物中添加更大體積的轉染復合物，這意味著(zhù)更長(cháng)的轉移時(shí)間。使用FectoVIR-AAV，轉移時(shí)間不再是可以導致病毒滴度產(chǎn)量變化的限制因素。FectoVIR-AAV轉染復合物顯示出極大的穩定性：將FectoVIR-AAV轉染試劑和質(zhì)粒DNA混合后，可以在6h內可靠地將轉染復合物添加到細胞中，而rAAV滴度產(chǎn)量沒(méi)有明顯變化。

▲ FectoVIR-AAV/ DNA復合物的長(cháng)期穩定性可確保工業(yè)規模的可靠滴定度。

靈活性：與各種商業(yè)培養基和細胞系統兼容

      合成細胞培養基的選擇特定于每個(gè)rAAV制造平臺。FectoVIR-AAV/DNA復合物的效率已在不同的市售合成復合介質(zhì)中進(jìn)行了全面測試，并且效價(jià)收率在各種測試介質(zhì)中的變化很小。

▲ FectoVIR-AAV與幾種可用于懸浮HEK-293細胞的合 成培養基兼容。

      總的來(lái)說(shuō)，與基因/細胞治療金標準領(lǐng)域的金標準PEIpro相比，FectoVIR -AAV可獲得其2-3倍高感染滴度的病毒載體，且整個(gè)操作過(guò)程增加了更多的彈性。轉染時(shí)復合物的穩定性可延長(cháng)至6小時(shí)，復合物工作體積由10%減至1%，此外，DNA的用量也可減少25%，在減少成本的同時(shí)給大規模瞬時(shí)轉染提供了諸多便利。GMP級用于臨床試驗的產(chǎn)品也已經(jīng)上市。

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