標題：Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9

期刊：Nat Commun

發(fā)表時(shí)間：2021年

影響因子：17.694

摘要

盡管細胞外囊泡(EVs)在細胞間通訊中發(fā)揮作用，但它們的不同種群及其分泌機制尚未完全表征：EVs如何以及在何種程度上形成為內吞隔室腔內囊泡 (外泌體) 或在質(zhì)膜 (PM) 上形成囊泡（ectosomes）仍不清楚。該研究跟蹤了EV標志物CD9和CD63從內質(zhì)網(wǎng)到它們的駐留區室，分別是PM和晚期內體的細胞內運輸。在它們最終分離之前，觀(guān)察到兩個(gè)地方的瞬時(shí)共定位。CD9和穩定在PM的突變CD63在EV中比CD63更豐富地釋放。因此，在HeLa細胞中，ectosomes比外泌體分泌更多。通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析和對內體pH中和的差異反應，確定了一些可能對外泌體 (LAMP1) 或ectosomes (BSG、SLC3A2) 具有特異性的表面蛋白。該研究工作為任何細胞類(lèi)型中外泌體和小ectosomes的分子和功能區分開(kāi)辟了道路。

引言

所有細胞都會(huì )在其環(huán)境中釋放膜包裹的囊泡，統稱(chēng)為細胞外囊泡 (EV)。這些 EV 包含來(lái)自其起源細胞的一組選定的脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)，因此可以將一系列復雜的信息傳輸到周?chē)蜻h處的細胞。EV 可以通過(guò)從原核和真核細胞的質(zhì)膜 (PM) 直接向外出芽形成。在真核細胞中，EV 也可以首先作為內吞途徑 (MVB) 的內部多泡隔室的腔內囊泡形成，然后在這些隔室與 PM 融合時(shí)分泌。為了闡明命名法，最近建議專(zhuān)門(mén)針對 MVB 衍生的 EV 使用術(shù)語(yǔ)“外泌體”，而不是針對所有小型 EV；另一方面，PM 衍生的 EV 被稱(chēng)為各種名稱(chēng)，例如微泡、微?；虬怏w。

由于它們在不同的亞細胞位點(diǎn)形成，外泌體和胞外體可能包含不同組的特定貨物，因此具有不同的功能。然而，由于難以將生物流體或細胞條件培養基中存在的相同大小的外泌體與外泌體分離，缺乏區分外泌體與胞外體的特異性蛋白質(zhì)標記，以及分子機制和具有對一個(gè)或另一個(gè)完全特異性的工具。

研究結果

01.CD63 和 CD9 存在于兩個(gè)不同的和一個(gè)共同的 EV 群體中

使用HeLa 細胞去研究分析EV的分布，免疫熒光結果表明 CD63 主要位于細胞內區室中。相反，CD9 主要存在于質(zhì)膜上，但也存在于罕見(jiàn)的暗淡細胞內區室中。在穩態(tài)下沒(méi)有觀(guān)察到兩種蛋白質(zhì)的明顯共定位。

02.CD63 和 CD9 短暫地通過(guò)晚期內體和 PM

pHluorin在酸性條件下實(shí)際上是無(wú)熒光的，但在中性pH時(shí)發(fā)出熒光，因此使其成為觀(guān)察酸性晚期胞內MVB與質(zhì)膜融合的理想報告分子。由于細胞外部環(huán)境處于中性pH，因此在融合過(guò)程中會(huì )發(fā)生酸到中性的轉換。免疫電鏡表明在所有時(shí)間點(diǎn)，大多數 MVB 和溶酶體僅包含 CD63 而不是 CD9。

03.  與 CD63 不同，CD9 和 CD63-YA 具有相似的 PM 定位和內化動(dòng)力學(xué)

溶酶體靶向基序進(jìn)行突變?yōu)镃D63-YA，CD63 - WT - eGFP或CD63 - YA - eGFP RUSH 質(zhì)粒轉染的 HeLa 細胞；結果顯示，在穩定狀態(tài)下，與 CD63-WT 相反，CD63-YA 主要位于細胞外圍和一些小的細胞內區室中。動(dòng)力監測結果顯示，突變體 CD63-YA 不會(huì )進(jìn)入酸性?xún)炔扛糸g；同時(shí)，用生物素處理后，結果顯示CD9 和 CD63-YA 在添加生物素后約 1 小時(shí)達到相似的表面 (AF647)/總 (GFP) 熒光強度比為 1，在穩態(tài)下進(jìn)一步增加至約 2；相比之下，對于 CD63，最大表面/總比值增加但保持低于 1，直到添加生物素后 2 小時(shí)，并在 2 小時(shí)和穩態(tài)之間下降，CD63-YA 和 CD9 表現相似并在質(zhì)膜上積累。

04. PM 蛋白在 CD9-EV 中富集，而內體/溶酶體和 PM 跨膜蛋白都在 CD63-EV 中富集

為了更好地確定CD63 +和CD9 + EV的起源，并鑒定PM或內體釋放的EV的特定標志物，研究者進(jìn)行了定量質(zhì)譜分析；同步分泌的 CD63 或 CD9 EV 的定量質(zhì)譜分析揭示了質(zhì)膜和內體衍生的 EV 的特征，PM 蛋白在 CD9-EV 中富集，而內體/溶酶體和 PM 跨膜蛋白都在 CD63-EV 中富集。

研究結論

這項工作旨在確定含有不同四跨膜蛋白的 EV 的實(shí)際外泌體或外泌體性質(zhì)。為了確定這些細胞釋放的 EV 的亞細胞起源，研究者通過(guò)時(shí)間控制的方式跟蹤四跨膜蛋白的細胞內運輸，從它們在內質(zhì)網(wǎng) (ER) 中的初始合成到它們在 EV 中的分泌。研究結果表明，CD63和CD9都可以在質(zhì)膜形成的小ectosomes中釋放，并且在HeLa細胞中，外泌體代表小EVs(sEVs) 的一個(gè)小亞群，它們攜帶CD63和其他晚期內體分子，如LAMP1/2。它們的分泌特別容易受到內體pH值的中和。BSG和SLC3A2被鑒定為HeLa細胞中ectosomes分泌的特定標記物，相反對內體pH中和不敏感。有趣的是，CD81是另一種常用作外泌體和/或小EV標記物的四跨膜蛋白，其行為類(lèi)似于CD9而不是CD63。此處確定的外泌體與ectosomes的特異性標志物和分子機制將為進(jìn)一步研究以破譯它們各自的功能鋪平道路。