食源性致病菌

      食品安全問(wèn)題是關(guān)乎人民生命健康和社會(huì )和諧的重大戰略問(wèn)題，而食品致病菌是全球范圍內導致食品安全問(wèn)題的主要因素。其中, 以金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、單核增生李斯特菌、腸炎沙門(mén)氏菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等為代表的食源性致病菌嚴重威脅著(zhù)消費者的健康, 由其引起的食源性疾病如腹痛、腹瀉以及嘔吐等癥狀近年來(lái)呈上升趨勢^[1]，世界衛生組織調查發(fā)現，在全球范圍內每年約有6億例食源性疾病發(fā)生，其中有42萬(wàn)人因此死亡。因此，盡早的發(fā)現食源性致病菌是防止食源性疾病暴發(fā)的有效手段。

      基于細胞培養的方法盡管一直以來(lái)被認為是食源性致病菌檢測的金標準，但該方法需要經(jīng)過(guò)增菌、選擇性培養、純化、生化反應鑒定等步驟^[2]，存在過(guò)程繁瑣，且檢測耗時(shí)長(cháng)等問(wèn)題，難以滿(mǎn)足目前的快速檢測需求。而基于抗原抗體特異性結合反應原理的檢測方法雖然操作相對簡(jiǎn)單，但靈敏性不足、容易造成漏檢。因此，開(kāi)發(fā)新型快速高效的食源性致病菌檢測技術(shù)是亟待解決的重要問(wèn)題。

 常規免疫檢測及核酸檢測原理

  CRISPR/Cas系統快速檢測原理

      CRISPR/Cas系統由成簇、規則間隔的短回文重復序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）和關(guān)聯(lián)蛋白（CRISPR-associated protein，Cas）組成。CRISPR/Cas系統來(lái)源于細菌和古細菌的適應性免疫系統^[4]。近些年發(fā)現的Cas12和Cas13蛋白在CRISPR RNA (crRNA)或向導 RNA (single-guide RNA，sgRNA)引導下，除了具有識別并剪切特異靶標的順式剪切活性外，還具有可被靶標激活的反式剪切活性。即這些 Cas蛋白與crRNA在特異性識別靶標后，可被激活針對ssDNA或ssRNA的反式剪切活性?；诖嗽?，可將反式剪切底物設計成合適的報告探針(如熒光-淬滅基團修飾)，即可用于靶標核酸檢測。

CRISPR/Cas技術(shù)檢測食源性致病菌

      致病菌的CRISPR/Cas核酸傳感器檢測可分為兩大類(lèi)：①通過(guò)增菌后提取基因組，結合核酸擴增和Cas蛋白的剪切體系建立的核酸傳感器。②結合適配體實(shí)現致病菌向核酸的轉化，隨后直接或間接與CRISPR/Cas系統結合，建立相應的傳感器^[5]。在上文中，我們提到了5種常見(jiàn)的食源性致病菌，接下來(lái)，編者將以這5種食源性致病菌為例，展開(kāi)論述現有的CRISPR/Cas檢測系統的原理及進(jìn)展。

金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的雙重檢測

      Gootenberg^[8]等基于重組酶聚合酶擴增技術(shù) (Recombinase Polymerase Amplification, RPA)和CRISPR/Cas13建立了RPA-CRISPR/Cas-雙重熒光檢測系統。通過(guò)多重RPA擴增，再將擴增產(chǎn)物轉錄得到RNA靶標，兩種不同的RNA靶標分別與Cas13a/crRNA、Cas13b/crRNA結合并激活對應Cas13蛋白的反式剪切活性。根據Cas13蛋白反式剪切探針的偏好性，采取Cas13a剪切poly U探針，Cas13b剪切poly A探針，兩種探針?lè )謩e標記不同的熒光基團，從而通過(guò)檢測兩種熒光信號強度的變化，實(shí)現對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的同時(shí)檢測。

 RPA-CRISPR/Cas-雙重熒光檢測系統對黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的檢測

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