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    學(xué)習質(zhì)粒圖譜我們怎么看

          載體是攜帶目的基因進(jìn)入宿主細胞的運載工具,是分子克隆技術(shù)不可或缺的重要組成部分,其中,質(zhì)粒是最常用的載體。面對日益繁多的質(zhì)粒,正確閱讀質(zhì)粒圖譜是進(jìn)行分子克隆的前提。本文將介紹如何閱讀質(zhì)粒圖譜。

     

    一、質(zhì)粒的概念及分類(lèi)

    1.概念

          質(zhì)粒是生物細胞內固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩定遺傳的一類(lèi)核酸分子。質(zhì)粒常見(jiàn)于原核細菌和真菌中,絕大多數的質(zhì)粒是DNA型的,少部分為RNA型。天然DNA質(zhì)粒大都具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結構,其分子量范圍為1-300 kb。

    天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標記不理想等缺陷,不能滿(mǎn)足基因工程載體的要求,因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎進(jìn)行人工構建,所以目前使用的質(zhì)粒多為人工改造的質(zhì)粒。

    理想的質(zhì)粒應滿(mǎn)足以下條件:

    ①復制能力:具有獨立的復制能力,在細胞中能大量繁殖,從而使目的基因大量擴增;

    ②表達能力:作為表達載體應能利用宿主的酶系統,表達目的基因; 

    ③穩定性高:細胞內能持續復制和表達;

    ④酶切位點(diǎn):具有適當的限制性核酸內切酶識別和切割位點(diǎn),即外源基因插入部位;

    ⑤遺傳標記:便于重組體的篩選和鑒定;

    ⑥分子量?。阂匀菁{較大的外源基因。

    2.分類(lèi)

    1)按功能分類(lèi):克隆載體、表達載體

           克隆載體(cloning vector):具有克隆載體的基本元件(復制起始位點(diǎn),抗性基因,多克隆位點(diǎn)等),可以攜帶DNA片段或外源基因進(jìn)入受體細胞并克隆和擴增DNA片段或基因的載體。

    表達載體(expression vector):除了具有克隆載體的基本元件外,還有可以表達調控目的基因的元件,即轉錄翻譯所必需的DNA序列。

    2)按受體細胞的類(lèi)型分類(lèi):原核載體、真核載體和穿梭載體

           原核載體(prokaryotic vector):能在原核細胞中復制和表達的載體真核載體(eukaryotic vector):能在真核細胞中復制和表達的載體

    穿梭載體(shuttle vector)也叫轉移載體(transfer vector),指在兩種宿主生物體內復制的載體分子,因而可以運載目的基因(穿梭往返兩種生物之間)。穿梭質(zhì)粒含原核和真核生物2個(gè)復制子,以確保能夠在原核和真核兩種宿主細胞中復制與擴增,并可以在真核細胞中有效表達。

     

    二、質(zhì)粒的基本元件

    1.復制起點(diǎn)(Origin of replication,ori)

           DNA復制起始位點(diǎn)ori負責控制質(zhì)粒復制的起始,原核生物DNA分子中只有一個(gè)復制起始位點(diǎn);而真核生物DNA分子有多個(gè)復制起始位點(diǎn)。若質(zhì)粒圖譜上只有一個(gè)ori,表示質(zhì)粒是原核克隆及表達質(zhì)粒;而圖譜上有兩個(gè)ori,則表示該質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒,既可以在原核也可以在真核中復制。

    2.啟動(dòng)子(promoter, P)

           與RNA聚合酶特異性結合,促進(jìn)基因轉錄的DNA序列。含有RNA 聚合酶特異性結合和轉錄起始所需的保守序列。

    真核細胞含有三類(lèi)RNA聚合酶,因此真核啟動(dòng)子還分為I、II、III類(lèi)啟動(dòng)。常見(jiàn)表達或者過(guò)表達都是II類(lèi)啟動(dòng)子,而III類(lèi)啟動(dòng)子如U6、H1,啟動(dòng)小片段如miRNA、shRNA、sgRNA等,其用于構建shRNA和sgRNA載體進(jìn)行敲低或敲除操作。

    Ⅱ型啟動(dòng)子在使用特點(diǎn)上又可分為三大類(lèi):組成型啟動(dòng)子(廣泛性啟動(dòng)子)、組織特異性啟動(dòng)子、誘導型啟動(dòng)子。

    此外,不同物種的表達體系具有不同的啟動(dòng)子,啟動(dòng)子啟動(dòng)基因表達也有強弱之分,因此我們需要根據自己的需求選擇含有相應啟動(dòng)子的質(zhì)粒。關(guān)于啟動(dòng)子的詳細介紹見(jiàn)往期推文。

    3.增強子(enhancer):增強目的基因轉錄

    4.篩選標記(selectable markers)

           多為抗生素抗性基因,方便后續篩選陽(yáng)性克隆。原核細胞篩選標記常用的是氨芐青霉素/氨芐西林Amp、氯霉素Cam、卡那霉素Kan、四環(huán)素Tet等;真核細胞篩選標記用的是嘌呤霉素Puro,新霉素neo/G418,潮霉素Hyg或Hygro等。質(zhì)粒圖譜中用抗生素縮寫(xiě)+R表示,R代表resistance,如AmpR和PuroR等。

    抗生素作用機制及用途見(jiàn)下表

     

    5. 多克隆位點(diǎn)(multiple cloning sites,MCS)

           外源 DNA的插入位點(diǎn),通常位于啟動(dòng)子的下游,具有多個(gè)核酸內切酶的酶切位點(diǎn),可通過(guò)酶切/連接方式將外源 DNA 插入到質(zhì)粒。質(zhì)粒圖譜中有些酶切位點(diǎn)右上角標注了“*”,代表可能并不僅僅存在單一限制位點(diǎn),所以一般不選用標有星號的酶切位點(diǎn)。

    6.轉錄終止信號(polyA  signal)

           轉錄到AAUAAA(AATAAA)之后,mRNA會(huì )接上polyA并轉錄終止。常見(jiàn)的轉錄終止信號位SV40 polyA,簡(jiǎn)寫(xiě)為SV40 pA

    7. 熒光基因

          可以用激光激發(fā)產(chǎn)生熒光的蛋白,一般會(huì )獨立表達或和目的基因融合表達的方式被設計在質(zhì)粒上,起到示蹤、陽(yáng)性檢測、成像的作用。如RFP、mCherry、GFP和EGFP等。

    8.蛋白標簽

          蛋白標簽大多為較短的短肽,一般融合表達在目的基因的3’端或5'端,如flag、HA、myc和his等。有了標簽,在缺乏針對目的蛋白的抗體時(shí)就可以很方便的對目的蛋白做檢測了

    9.其他調控元件

    WPRE:來(lái)自土撥鼠肝炎病毒的轉錄后調節元件,放置在目的基因的上游,能加強目的基因的表達。

    cPPT:來(lái)自HIV-1整合酶基因,增加慢病毒在宿主基因組的拷貝數,提高病毒滴度。

     

    三、如何閱讀質(zhì)粒圖譜

    pLKO.1-Puro質(zhì)粒(常用于構建shRNA載體)為例,對質(zhì)粒圖譜進(jìn)行解讀

     

    1.首先看箭頭方向

          質(zhì)粒圖譜上都會(huì )存在箭頭,箭頭方向可以代表轉錄方向如圖中U6、hPGK、AmpR等啟動(dòng)子(白色箭頭)的方向,也可以代表復制方向,即 ori(黃色箭頭)的箭頭方向。設計引物及插入目的基因的方向是根據轉錄方向(啟動(dòng)子方向)來(lái)定的。由于質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA,箭頭可有順時(shí)針和逆時(shí)針?lè )较?,代表兩條DNA鏈,它的啟動(dòng)子在其中一條鏈上,而它的某些基因在另一條鏈上。

    2.看ori鑒別質(zhì)粒類(lèi)型

          前文提到,若質(zhì)粒圖譜上只有一個(gè)ori,表示質(zhì)粒是原核克隆及表達質(zhì)粒;而圖譜上有3個(gè)ori,則表示該質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒。因此該質(zhì)粒為穿梭質(zhì)粒。

     

     

     

    3.看啟動(dòng)子確定質(zhì)粒的作用

           該質(zhì)粒圖譜中有7個(gè)啟動(dòng)子(白色箭頭),U6啟動(dòng)子可用于構建shRNA和sgRNA載體;hPGK和AmpR啟動(dòng)子啟動(dòng)Puro和Amp抗性基因的表達,可用于篩選陽(yáng)性克隆。T3和T7啟動(dòng)子分別是噬菌體T3和T7 RNA聚合酶的啟動(dòng)子,lac啟動(dòng)子是大腸桿菌乳糖操縱子的啟動(dòng)子,RSV啟動(dòng)子是rous肉瘤病毒增強子/啟動(dòng)子。

     

    4.看篩選標記/抗性基因

           圖中有AmpR(氨芐西林抗性基因)和PuroR(嘌呤霉素抗性基因),AmpR用于原核細胞如大腸桿菌篩選,PuroR用于真核細胞如腫瘤細胞的篩選。當大腸桿菌和腫瘤細胞中不存在該質(zhì)粒時(shí)就無(wú)法表達抗性基因,因此應用氨芐西林或嘌呤霉素可以篩選出陽(yáng)性克隆。各抗生素作用機制與用途見(jiàn)前文。

     

    5.看多克隆位點(diǎn)

           該質(zhì)粒圖譜中圓圈外圍的黑體字母代表酶切位點(diǎn),可用于插入外源基因。pLKO.1-Puro質(zhì)粒常用于構建shRNA載體,插入的shRNA靶序列位于U6啟動(dòng)子下游且緊鄰U6啟動(dòng)子。針對該質(zhì)粒,我們常選用AgeI和EcoRI這兩個(gè)酶切位點(diǎn)引入外源shRNA靶序列。

     

    6.看轉錄終止信號

           質(zhì)粒圖譜中pA或者poly A代表轉錄終止信號。

     

    7.熒光標記

          有的質(zhì)粒帶有熒光標記,用于直觀(guān)判斷質(zhì)粒是否轉染成功。如下圖所示,與pLKO.1-Puro相比,pLKO.1-EGFP-Puro主要不同在于多了CMV啟動(dòng)子/增強子和EGFP序列(箭頭表示),CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)EGFP(增強的綠色熒光蛋白)的表達。其余部分與pLKO.1-Puro相差不大。

     

     

    8.其他

            回到pLKO.1-Puro質(zhì)粒,長(cháng)末端重復序列(long terminal repeats,LTR)存在于反轉錄病毒基因組的兩端,即5’ LTR和3’LTR,不編碼蛋白質(zhì),但含有啟動(dòng)子,增強子等調控元件。

    cPPT來(lái)自HIV-1整合酶基因,增加慢病毒在宿主基因組的拷貝數,提高病毒滴度。

    M13 fwd和M13 rev是M13上下游通用引物,可用于后續測序。

    CAP binding site(CAP結合位點(diǎn))在cAMP存在時(shí)激活轉錄。

    HIV-1Ψ是人類(lèi)免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的包裝信號。 

    RRE(Rev response element)允許Rev依賴(lài)的mRNA從細胞核輸出到細胞質(zhì)。

    gp41 peptide介導HIV與CD4細胞融合,從而HIV進(jìn)入細胞內。

     

    想必通過(guò)上面的講解,大家對質(zhì)粒圖譜的閱讀應該有大致的了解,那就找幾張質(zhì)粒圖譜練習吧??稍?/span>addgene網(wǎng)站(https://www.addgene.org/)搜索想要的質(zhì)粒。如圖:

     


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