2020年，Jennifer Doudna教授和Emmanuelle Charpentier博士所發(fā)現的CRISPR-Cas9“基因剪刀”被授予諾貝爾化學(xué)獎。隨后，CRISPR-Cas技術(shù)得到快速發(fā)展，在很短的時(shí)間內完成了由基礎理論到初步科學(xué)驗證，進(jìn)入到多種不同的應用領(lǐng)域。

     在IVD領(lǐng)域，基于CRISPR-Cas為基礎所開(kāi)發(fā)的新興診斷被用于傳染病和癌癥監測中，并以其快速、便攜、經(jīng)濟、高效等特點(diǎn)為分子檢測帶來(lái)革新。讓我們一起來(lái)總結CRISPR技術(shù)中的幾位"大主角"，cas9、cas12、cas13、cas14蛋白所延伸的分子診斷技術(shù)。為行業(yè)內的學(xué)者、科研人員和工作者帶來(lái)一些啟發(fā)。如何選擇自己實(shí)驗中合適的cas蛋白酶本文將要闡述下幾種酶的區別。

Cas9蛋白

      Cas9是一種DNA內切酶，Cas9內切酶必須在向導RNA分子的引導下對DNA進(jìn)行切割，這是因為這些向導RNA分子含有與靶DNA序列互補的序列，稱(chēng)之為PAM序列。Cas9蛋白精確的平端切割位點(diǎn)位于PAM上游3個(gè)核苷酸位置，形成平末端產(chǎn)物。Cas9蛋白的HNH結構域負責切割與crRNA互補配對的那一條DNA鏈，而RuvC結構域負責切割另外一條非互補DNA鏈。最終在Cas9的作用下DNA雙鏈斷裂（DSB）形成雙鏈DNA缺口，然后細胞會(huì )借助同源重組機制(homologous recombination)或者非同源末端連接機制(non-homologous end joining)對斷裂的DNA進(jìn)行修復，進(jìn)而實(shí)現DNA片段的敲除或敲入。

Cas9的應用：

      Cas9含有兩個(gè)具有切割活性的結構域：HNH結構域和RuvC結構域，其中HNH結構域切割與crRNA互補的DNA鏈，而RuvC結構域切割非互補鏈。RuvC結構域可分為三個(gè)亞結構域：RuvC I、RuvC II和RuvC III，RuvC I接近于Cas9的氨基端，RuvC II和RuvC III位于HNH結構域的兩側。僅對Cas9中的RuvC I進(jìn)行突變，具體而言就是讓RuvC I的兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基中的一個(gè)轉換成丙氨酸（D10A或H840A），從而得到Cas9切口酶（Cas9 nickase, Cas9n）。這種切口酶不能切割非互補DNA鏈，僅能切割與crRNA互補的DNA鏈，能夠明顯減少脫靶效應，同時(shí)保持高效的基因修飾。 

通過(guò)點(diǎn)突變的方式使Cas9的兩個(gè)結構域RuvC-和HNH-失去活性，其中RuvC催化結構域的第10位天冬氨酸突變?yōu)楸彼幔?/span>D10A）以及HNH催化結構域的第840位組氨酸突變?yōu)楸彼幔?/span>H840A），Cas9蛋白將失去核酸內切酶活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介導下結合靶基因，而不具備剪切DNA的功能。因此，將dCas9結合到基因的轉錄起始位點(diǎn)，可以阻斷轉錄的開(kāi)始，從而抑制基因表達；將dCas9結合到基因的啟動(dòng)子區域也可以結合轉錄抑制/活化物，使下游靶基因轉錄受到抑制或激活。因此dCas9與Cas9、Cas9 nickase的不同之處在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不會(huì )對基因組DNA造成不可逆轉的改變。

Cas12 蛋白

      CRISPR–Cas12a蛋白，以前稱(chēng)為Cpf1，是一種內切核酸酶，可以通過(guò)向導RNA進(jìn)行編程，以靶向互補的DNA序列。在與靶DNA結合后，CRISPRCas12a蛋白在每條靶DNA鏈中誘導切割，產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。除了誘導靶DNA的順式切割之外，靶DNA結合還誘導非靶DNA的反式切割。因此，CRISPR Cas12a-RNA向導復合物可以提供針對入侵核酸（例如噬菌體和質(zhì)粒）的序列特異性免疫。類(lèi)似于CRISPR/Cas9，Cas12a已被重新用作原核和真核細胞中可編程基因組編輯和轉錄控制的遺傳工具。此外，其反式切割活性已應用于高靈敏度核酸檢測。CRISPR/Cas12a系統的脫靶率將比Cas9低得多，并且因為它與Cas9的諸多不同，它將能與CRISPR/Cas9互補，從而擴大CRISPR/Cas系統的工具箱，使基于CRISPR/Cas系統的基因編輯技術(shù)具有更強的普適性和編輯能力。

      Cas12b核酸酶（又名C2c1）是依賴(lài)于RNA介導的內切核酸酶，在靶標DNA存在PAM的情況下，可特異地切割靶標雙鏈DNA。Cas12b蛋白比Cas9和Cas12a更小，且來(lái)源于嗜酸耐熱菌且切割活性較高的Alicyclobacillus acidoterrestris。Cas12b的最佳切割反應溫度為48 ℃。和同家族的Cas12a類(lèi)似，Cas12b也識別5'-TTN的PAM序列，切割DNA后也產(chǎn)生粘性末端；然而，Cas12b是雙RNA導向，依賴(lài)于crRNA和tracrRNA（或連接后形成的sgRNA）。此外，Cas12b不僅可以應用于靶標dsDNA的切割，還可以用于靶標核酸的快速檢測，詳見(jiàn)HOLMESv2核酸快檢技術(shù)。

Cas13 蛋白

      Cas13蛋白可進(jìn)一步分為4個(gè)亞型，即CRISPR-Cas13a,b,c,d。除了Cas13c的相關(guān)研究目前還不充分外，另外3中Cas蛋白已經(jīng)有了比較廣泛的研究和應用。

Cas13a核酸酶（又名 C2c2）是依賴(lài)于 RNA 介導的 RNA 內切核酸酶。在靶標單鏈 RNA 存在 PFS序 列的情況下，可特異地切割靶標 RNA。此外，Cas13a 還具有依賴(lài)于靶標單鏈 RNA 的反式切割活性，可用于開(kāi)發(fā)靶標核酸的快速檢測試劑盒。例如，MIT的張鋒團隊便利用 Cas13a 蛋白開(kāi)發(fā)了名為“SHERLOCK”的下一代分子診斷系統。對于細菌而言，Cas13a這種反式切割活性是有意義的。若細菌被噬菌體感染，它能夠激活程序性細胞死亡或休眠狀態(tài)，以限制感染在整個(gè)群體中的傳播。像Cas13a一樣，Cas13b僅需要單個(gè)向導RNA就能靶向目的序列，此外，Cas13b能夠同時(shí)靶向多個(gè)RNA轉錄本。

而此后發(fā)現的Cas13d，具有更高的效率、更低的脫靶率，更重要的是，Cas13d相比其他Cas13家族成員具有更小的尺寸，能夠更容易包裝到病毒載體中，因此具有更好的遞送優(yōu)勢和應用前景。

Cas14 蛋白

      除了上述幾種具有靶向切割能力的Cas蛋白之外，近期發(fā)現的Cas14 也具有類(lèi)似的功能。

Cas14a核酸酶是一種內切核酸酶，其在tracrRNA:crRNA（或sgRNA）的引導下，特異結合并切割靶標ssDNA，且無(wú)需PAM位點(diǎn)。相比于其他的Cas蛋白，Cas14蛋白的分子量普遍較?。?/span>400-700aa）；與Cas12類(lèi)似，Cas14a也可以結合靶標核酸并激活其ssDNA反式切割活性。研究人員認為，Cas14的切割對象是單鏈DNA，而不是雙鏈DNA，因此未必是良好的基因組編輯工具。不過(guò)，他們認為Cas14可用在DETECTR診斷工具中。

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