水稻干尖線(xiàn)蟲(chóng)又稱(chēng)貝西滑刃線(xiàn)蟲(chóng) (Aphelenchoides besseyi)，是水稻白尖病的致病因子，該線(xiàn)蟲(chóng)通過(guò)種子進(jìn)行傳播，寄生于種子中在干燥的條件下可存活3年。其所引起的水稻干尖線(xiàn)蟲(chóng)病廣泛發(fā)生在世界各國水稻產(chǎn)區，嚴重感染可造成50%的產(chǎn)量損失。同時(shí)，水稻干尖線(xiàn)蟲(chóng)寄主范圍廣泛，除水稻外還可以寄生35個(gè)屬200多種植物，且該線(xiàn)蟲(chóng)還可以取食多種真菌，被列為全球危害最為嚴重的十大植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)之一。因此，快速、高特異性、準確地檢測水稻種子中的水稻干尖線(xiàn)蟲(chóng)是監測、預防和控制水稻白尖病的重要手段。針對于此，上海市農科院作物育種栽培研究所農業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗室曹黎明團隊等[1]開(kāi)發(fā)了一種新穎的RPA-Cas12a-Ab方法來(lái)檢測水稻干尖線(xiàn)蟲(chóng)，研究中所使用的Cas12/13試紙條購自南京沃博生物科技有限公司，Cas12a購自吐露港生物科技有限公司。

01：建立RPA-Cas12a-Ab檢測體系

該方法的技術(shù)路線(xiàn)是將CRISPR/Cas12a與RPA技術(shù)相結合，具體來(lái)說(shuō)，首先37℃下進(jìn)行20分鐘水稻干尖線(xiàn)蟲(chóng)核酸的RPA擴增，隨后擴增產(chǎn)物進(jìn)行20分鐘 CRISPR/Cas12a反應即可通過(guò)熒光分析儀讀取結果。為了方便現場(chǎng)檢測，可采用側流層析試紙條進(jìn)行讀取，耗時(shí)約5分鐘（圖1）。使用熒光分析儀時(shí)，該體系的LOD可達到1 copy/μL含目標片段的質(zhì)粒；結合側流層析試紙條檢測，該體系的LOD可達到1000 copies/μL含目標片段的質(zhì)粒。

圖1.RPA-Cas12a-Ab檢測示意圖

對于水稻干尖線(xiàn)蟲(chóng)的核酸提取，作者采用的是改進(jìn)的貝爾曼漏斗法。而后對提取的核酸進(jìn)行RPA擴增。為達到檢測性能最佳，首先對RPA引物進(jìn)行評估，在25°C、28°C、32°C、35°C、37°C、39°C、42°C和45°C不同溫度下對含有線(xiàn)蟲(chóng)目標片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行擴增，所有溫度下均能擴增，但為了方便實(shí)驗操作和對降低設備的要求，后續RPA反應選擇37°C，該溫度也有利于Cas12a活性的發(fā)揮（圖2）。

圖2.不同溫度下的RPA擴增

緊接著(zhù)，作者選用ToloBio提供的的LbCas12a（#32108-03，Tolo Biotech, Anhui, China），利用該酶的反式切割活性建立了CRISPR檢測體系。crRNA是影響Cas12a反式切割活性的主要因素，所以作者針對水稻干尖線(xiàn)蟲(chóng)目標片段設計了8條crRNA進(jìn)行crRNA的篩選，最終選擇高活性的crRNA5用于后續檢測，該crRNA5可在20分鐘時(shí)間內獲得理想的結果（圖3）。

                                                                              圖3.不同crRNA的篩選

02：RPA-Cas12a-Ab檢測體系的性能測試

初步建立 RPA-Cas12a-Ab檢測體系后，研究者們測試了該體系的特異性。結果表明，RPA-Cas12a-Ab檢測體系對2例水稻干尖線(xiàn)蟲(chóng)樣本（AB1、AB2）和含水稻干尖線(xiàn)蟲(chóng)目標片段的質(zhì)粒檢測呈陽(yáng)性；而對3例非水稻干尖線(xiàn)蟲(chóng)樣本（AF、AS、MI），以及水稻葉片基因組樣本（Rice Leaf）均無(wú)擴增，也無(wú)CRISPR檢切信號，結果為陰性。證明了RPA-Cas12a-Ab檢測方法的特異性（圖4）。

圖4. RPA-Cas12a-Ab特異性驗證

作者使用含有水稻干尖線(xiàn)蟲(chóng)目標片段的重組質(zhì)粒pUC57-18S對RPA-Cas12a-Ab檢測體系的靈敏度進(jìn)行了測試，同步對比PCR與qPCR檢測方法。PCR和qPCR的LOD分別為為10³和10¹ copies/μL，而RPA-Cas12a-Ab測定的LOD達到了1 copy/μL，證明了RPA-Cas12a-Ab測定在水稻干尖線(xiàn)蟲(chóng)檢測中比PCR和qPCR方法更靈敏。使用提取的水稻干尖線(xiàn)蟲(chóng)的基因組DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋后，RPA-Cas12a-Ab可成功檢出10^-7稀釋的基因組DNA樣本（圖5）。

圖5. RPA-Cas12a-Ab靈敏度測試

03：RPA-Cas12a-Ab結合試紙條用于現場(chǎng)快速檢測

為便于現場(chǎng)檢測及方便用戶(hù)，作者將RPA-Cas12a與LFA技術(shù)相結合，建立了RPA-Cas12a-Ab-LFA檢測方案。同樣地，作者對此簡(jiǎn)易化檢測系統進(jìn)行了特異性和靈敏度的驗證。水稻干尖線(xiàn)蟲(chóng)樣品（AB1和AB2）顯示出與陽(yáng)性對照相似的清晰條帶，非水稻干尖線(xiàn)蟲(chóng)樣品（AF，AS和MI）未觀(guān)察到交叉反應，這也證明了RPA-Cas12a-Ab-LFA檢測體系的特異性。使用含有水稻干尖線(xiàn)蟲(chóng)目標片段的重組質(zhì)粒pUC57-18S和提取的水稻干尖線(xiàn)蟲(chóng)的基因組DNA進(jìn)行10倍梯度稀液后測試靈敏度，結果表明，該系統可檢測到1000 copies/μL的含目標片段質(zhì)粒樣本，或是10^-1稀釋的水稻干尖線(xiàn)蟲(chóng)基因組DNA提取樣本（圖6）。

圖6.RPA-Cas12a-Ab-LFA特異性、靈敏度驗證總結

總結：

總的來(lái)說(shuō)，作者開(kāi)發(fā)了一種新穎的RPA-Cas12a-Ab（-LFA）檢測方法，不依賴(lài)于復雜的設備和熟練的操作人員，RPA擴增和CRISPR/Cas12a反應均可在37℃下完成，僅需一臺熒光分析儀或試紙條即可完成快速檢測，可在45分鐘內獲得高靈敏、高特異性的檢測結果。此開(kāi)發(fā)思路可廣泛應用于其它作物感染疾病或不同病原體的檢測。

相關(guān)產(chǎn)品

Cas酶系列：

 恒溫擴增試劑盒及試紙條系列：

參考文獻：

[1].Zhang A, Sun B, Zhang J, et al. CRISPR/Cas12a Coupled With Recombinase Polymerase Amplification for Sensitive and Specific Detection of Aphelenchoides besseyi[J]. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2022, 10: 912959.