文獻分享

Real-time recombinase-aided amplifcation assay for rapid amplifcation of the IS1081 gene of Mycobacterium tuberculosisYuanyuan Liu,Weicong Ren,Zhongtan Xue,Yuedong Miao,Wei Wang,Xuxia Zhang,Cong Yao,Yuanyuan Shang,Shanshan Li,Fengling Mi, Yu PangReceived: 24 February 2023 / Accepted: 23 May 2023

01  背景

結核病是世界上最緊迫的公共衛生問(wèn)題之一。根據2022年世界衛生組織（WHO）全球結核病報告顯示，2021年全球約1060萬(wàn)例新發(fā)結核病患者，死亡160萬(wàn)例，而結核病的確診率卻只有63%。目前結核病確診手段耗時(shí)長(cháng)，診斷延誤會(huì )增加傳播的機會(huì )。因此，開(kāi)發(fā)一種快速、簡(jiǎn)單、靈敏的結核分枝桿菌檢測方法尤為重要。

首都醫科大學(xué)附屬北京胸科醫院副書(shū)記龐宇老師課題組在《European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases 》期刊上發(fā)表文章《Real-time recombinase-aided amplifcation assay for rapid amplifcation of the IS1081 gene of Mycobacterium tuberculosis》，影響因子4.5。

課題組開(kāi)發(fā)了一種新的基于MIRA的分子檢測方法，從臨床標本中鑒定結核桿菌。依據文中實(shí)驗結果顯示，在結核病患者的臨床診斷中，MIRA技術(shù)檢測相對于qPCR的敏感性甚至有一定優(yōu)勢。

02   研究方法

課題組使用含有H37RvfullengthIS1081基因的重組質(zhì)pEASY-Blunt-IS1081進(jìn)行連續稀釋分析，檢測限為163個(gè)拷貝/反應。與傳統qPCR相比，MTB的檢測靈敏度提高了約1.5倍。

且在11個(gè)非結核分枝桿菌和其他臨床細菌的特異性實(shí)驗中，MIRA技術(shù)的特異性表現優(yōu)秀

03   實(shí)驗結果

靈敏度

采用含有IS1081基因全長(cháng)的連續稀釋重組質(zhì)粒，測定實(shí)時(shí)MIRA檢測MTB的靈敏度，并與qPCR進(jìn)行比較。如上圖a和c所示，兩種檢測方法的檢測限均為每反應100拷貝。并做了Probit回歸分析，MIRA技術(shù)檢測在95%概率下的擴增限為163拷貝，而qPCR的擴增限為244拷貝。

特異性

分別對結核分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、異種分枝桿菌、偶然分枝桿菌、龜分枝桿菌、海洋分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、豬分枝桿菌等陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測。結果只有結核分枝桿菌呈現陽(yáng)性，見(jiàn)上圖曲線(xiàn)16。

 臨床樣本測試

為了驗證實(shí)時(shí)MIRA的方法的臨床性能，課題組檢測了173份臨床痰標本,臨床樣本分為5組：高、中、低、極低和陰性。以Xpert為金標準，MIRA的檢出率為72.5%，明顯高于qPCR的53.8%。

 實(shí)驗結論

 除了具有良好的診斷準確性外，MIRA技術(shù)對結核病患者的臨床診斷具有多種優(yōu)勢：

? MIRA技術(shù)和qPCR 有著(zhù)同等的靈敏度和特異性。

?檢測可以在15-30 min內完成，優(yōu)于qPCR（120 min）和LAMP（40 min），從而在結核病中提供了一種潛在的替代POCT。

? 采用42°C的恒溫溫度擴增標本模板DNA。除了實(shí)時(shí)監測熒光信號外，在480 nm燈下，肉眼也可以檢測到擴增子。

?MIRA技術(shù)不需要復雜的實(shí)驗室環(huán)境和熟練的實(shí)驗人員，這更適合在資源有限的環(huán)境中擴大規模。

?相比于qPCR，MIRA試劑檢測的成本較低，可成為結核病流行國家常規使用的方法。