染色質(zhì)免疫沉淀法(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)是一種基于抗原抗體反應的特異性，從而起到選擇性地使DNA結合蛋白及其DNA靶標富集的作用，是在全基因組水平研究生命體組織或細胞內蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種技術(shù)方法。近年來(lái)，隨著(zhù)生物技術(shù)的迅速發(fā)展，ChIP 技術(shù)不斷發(fā)展和完善， 被廣泛應用于體內轉錄調控因子與靶基因啟動(dòng)子上特異核苷酸序列結合方面的研究， 并成為在染色質(zhì)水平研究基因表達調控的有效方法。特別是，此技術(shù)與 DNA 芯片和分子克隆技術(shù)相結合，可用于高通量篩選已知蛋白因子的未知DNA 靶位點(diǎn)和研究反式作用因子在整個(gè)基因組上的分布情況，這將有助于深入研究DNA 與蛋白質(zhì)相互作用的調控網(wǎng)絡(luò )。

                                  圖1. 染色質(zhì)免疫沉淀

技術(shù)原理：

       在活細胞狀態(tài)下，當用甲醛處理時(shí)，相互靠近的蛋白與蛋白、蛋白與核酸（DNA或RNA）之間會(huì )產(chǎn)生共價(jià)鍵。細胞內，當TF與Promoter相互結合時(shí)，它們必然靠的比較近或者契合在一起，這個(gè)時(shí)候用甲醛處理，能使它們之間產(chǎn)生共價(jià)鍵。固定的蛋白質(zhì)－DNA復合物通過(guò)超聲或酶處理將其隨機切斷為一定長(cháng)度范圍內的染色質(zhì)小片段，然后通過(guò)抗原抗體的特異性識別反應沉淀此復合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，通過(guò)對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。通過(guò)qPCR或二代測序，篩選與目的蛋白互作的未知DNA信息。

                                                                          圖2. 染色質(zhì)免疫共沉淀原理

實(shí)驗流程：

1、交聯(lián)和裂解

作用：將細胞或組織進(jìn)行固定（交聯(lián)）與裂解。

新鮮組織或活細胞中加入甲醛，目的是穩定蛋白與DNA天然結合的狀態(tài)，以免后續的實(shí)驗步驟破壞這種相互作用。在固定完成后，細胞或組織進(jìn)行充分裂解。

2、染色質(zhì)片段化

作用：細胞核材料片段化是獲得良好的 ChIP 分辨率的關(guān)鍵因素，理想情況下的片段大小在 200 到 800 bp對之間。剪切是最難控制的步驟之一。

 將染色質(zhì)打斷成200-500 bp的小片段，在后續實(shí)驗中，結合了目的蛋白的片段將被抗體識別而保留，沒(méi)有結合目的蛋白的小片段則將被洗脫。在進(jìn)行后續的實(shí)驗前，一般會(huì )將打斷后的樣品取一部分進(jìn)行解交聯(lián)和DNA純化，通過(guò)瓊脂糖電泳或者毛細管電泳檢測其片段化范圍是否符合下游實(shí)驗的需求。

注意：此時(shí)可以停 止ChIP。經(jīng)過(guò)剪切/消化染色質(zhì)后，可以將樣品于 -80°C 儲存。避免反復凍融。

3、免疫沉淀與DNA純化

作用：此步驟通過(guò)目的蛋白的特異抗體，對“DNA-目的蛋白”復合物進(jìn)行富集與洗脫。后續進(jìn)行解交聯(lián)與蛋白消化，最后純化DNA分子。

 IP實(shí)驗除了有實(shí)驗組，還應該有陽(yáng)性對照、陰性對照和空磁珠組，用以質(zhì)控IP實(shí)驗流程是否合格。實(shí)驗組加入目的蛋白對應的抗體，抗體應該選用IP級別的抗體，WB抗體不一定能滿(mǎn)足IP實(shí)驗，具體參見(jiàn)抗體說(shuō)明。陽(yáng)性對照一般選用已知的組蛋白抗體；陰性對照采用與目的蛋白抗體相同種屬來(lái)源的血清；空磁珠組則不加任何抗體。

注意：此時(shí)可以停 止ChIP。經(jīng)過(guò)解交聯(lián)和/或 DNA 純化后，可以將樣品于 -20°C 儲存。

4、定量 DNA

作用：qPCR可以對目的片段進(jìn)行定量分析。通過(guò)對目的序列的擴增，并與Input、陽(yáng)性對照和陰性對照的量對比，就可以證明目的蛋白是否與預想的DNA序列發(fā)生了相互作用。

 ChIP-Seq 是將回收純化的DNA進(jìn)行建庫測序，用于發(fā)現目的蛋白潛在結合的DNA序列。

(1) 交聯(lián)：甲醛是最常用的交聯(lián)劑，具有形成可逆交聯(lián)的優(yōu)勢。然而，需控制交聯(lián)時(shí)間，過(guò)長(cháng)的交聯(lián)時(shí)間可能導致超聲波破碎困難，甚至引起蛋白質(zhì)與DNA的非直接結合。此外，經(jīng)甲醛固定后，消化酶可能無(wú)法再進(jìn)行消化。

 (2) 染色質(zhì)切割：使用超聲破碎時(shí)，需要優(yōu)化條件以獲得200–500 bp的染色質(zhì)片段。影響超聲破碎的因素包括樣品體積、超聲探頭深度、超聲強度和超聲時(shí)間。建議在4°C條件下進(jìn)行超聲。核酸酶消化須嚴格監控時(shí)間，以防止過(guò)度消化導致的亞核體形成，這會(huì )干擾后續DNA-蛋白質(zhì)互作檢測。

 (3) 抗體選擇：選擇合適的抗體對實(shí)驗成功至關(guān)重要。推薦選用免疫沉淀級別（IP級別）的抗體，并根據需求選擇單克隆或多克隆抗體。單抗具有較高的特異性，但識別位點(diǎn)單一；若目的蛋白的識別位點(diǎn)被其它分子阻塞，則可能無(wú)法有效識別。根據所選抗體類(lèi)型，配合使用Protein A或G磁珠。

 (4) 操作要點(diǎn)：整個(gè)實(shí)驗過(guò)程應盡量在4°C下進(jìn)行，以保持樣本的穩定性。操作時(shí)應避免產(chǎn)生氣泡，以防影響反應效率和結果準確性。

 (5) 結果分析：獲得DNA片段并不直接證明目的蛋白與DNA的直接結合。如果與目的蛋白形成復合物的其它蛋白與DNA有結合作用，也可能使DNA富集。因此，在解釋結果時(shí)需考慮其他可能性。