近日，中國農業(yè)科學(xué)院深圳農業(yè)基因組研究所（嶺南現代農業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗室深圳分中心）聯(lián)合武漢大學(xué)中南醫院在學(xué)術(shù)期刊《自然·通訊（Nature Communications）》上在線(xiàn)發(fā)表了題為“CoHIT: a one-pot ultrasensitive ERA-CRISPR system for detecting multiple same-site indels”的研究論文

近日，中國農業(yè)科學(xué)院深圳農業(yè)基因組研究所（嶺南現代農業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗室深圳分中心）聯(lián)合武漢大學(xué)中南醫院在學(xué)術(shù)期刊《自然·通訊（Nature Communications）》上在線(xiàn)發(fā)表了題為“CoHIT: a one-pot ultrasensitive ERA-CRISPR system for detecting multiple same-site indels”的研究論文。該研究利用蛋白進(jìn)化和理念創(chuàng )新，實(shí)現對同一基因位點(diǎn)上大量不同類(lèi)型的突變（indels）進(jìn)行快速、精準且簡(jiǎn)便的檢測。CoHIT檢測技術(shù)采用了一管法操作流程，從樣品準備到最終結果讀取，整個(gè)過(guò)程在常溫下僅需30分鐘，且能精準檢測到萬(wàn)分之一的核酸變異。該技術(shù)有望在精準分子育種、食品安全監控、傳染病早期預警、遺傳疾病篩查及腫瘤精準診療等多個(gè)領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。

精準核酸檢測在疾病診斷、精準醫療及農業(yè)應用等領(lǐng)域具有重要意義。然而，目前臨場(chǎng)快速核酸檢測方法在面對同一基因位點(diǎn)的多種indels時(shí)，往往面臨檢測覆蓋率不足的挑戰。為了解決這一問(wèn)題，研究團隊利用蛋白進(jìn)化技術(shù)篩選出具有高耐受度的Cas蛋白，并創(chuàng )新性地提出了利用單一crRNA識別多種突變類(lèi)型的理念，成功構建了CoHIT（Cas12a-based One-for-all High-speed Isothermal Test）新型CRISPR檢測平臺。

圖1 | CoHIT檢測技術(shù)

CoHIT系統的核心在于一種改良的AsCas12a蛋白，即enAsU-R，它僅需一條crRNA就能靶向多個(gè)不同的變異體。通過(guò)對AsCas12a的功能區域進(jìn)行氨基酸替換，研究人員成功提高了蛋白的錯配耐受性和PAM性能，使其能識別與crRNA序列有少量堿基錯配的靶標DNA。在CoHIT檢測系統中，Cas12a/crRNA復合體能識別并切割多個(gè)Indel變異體，從而觸發(fā)ssDNA切割活性，釋放出熒光信號，而野生型DNA則由于與crRNA識別序列的不同而無(wú)法引發(fā)熒光信號，保證了檢測的特異性。

圖2 | 對Cas12a變體進(jìn)行工程改造以提高錯配耐受性

通過(guò)一系列參數優(yōu)化，包括緩沖液配方、反應溫度和組分濃度調整，CoHIT技術(shù)對NPM1基因突變的常見(jiàn)亞型達到了0.01%的檢測靈敏度，且在30分鐘內迅速給出結果，同時(shí)有效避免了野生型DNA的交叉反應。這一特性使得CoHIT在急性髓系白血?。ˋML）患者NPM1突變檢測中表現卓越，準確檢測出108名患者中的30名攜帶NPM1突變個(gè)體，且在監測微小殘留病灶（MRD）方面展現了巨大的潛力。

圖3 | 使用CoHIT系統檢測臨床樣本和MRD

此外，通過(guò)與側向流檢測條（LFA）和微流控芯片的結合，CoHIT系統的適應性和多重檢測能力得到了顯著(zhù)提升，為現場(chǎng)即時(shí)檢測提供了可能。研究人員建立了CoHIT-LFA系統，實(shí)現了現場(chǎng)快速檢測。同時(shí)，CoHIT技術(shù)與微流控裝置集成，通過(guò)一次上樣即可同時(shí)檢測7個(gè)靶標，展示了CoHIT檢測的靈活性和多路復用潛力。

圖4 | CoHIT-LFA系統及基于微流控芯片的CoHIT檢測

CoHIT技術(shù)的成功研發(fā)和不斷優(yōu)化，不僅簡(jiǎn)化了檢測流程，還大大提升了檢測速度與準確性，為分子育種、疾病早期診斷、遺傳病篩查和食品安全監測等眾多領(lǐng)域提供了強有力的工具。

武漢大學(xué)中南醫院博士后劉銀和中國農業(yè)科學(xué)院深圳農業(yè)基因組研究所劉馨怡副研究員為該論文共同第一作者，武漢大學(xué)中南醫院周芙玲教授和中國農業(yè)科學(xué)院深圳農業(yè)基因組研究所王鑫杰研究員與李奎教授為該論文共同通訊作者。本研究得到了國家自然科學(xué)基金、廣東省粵深聯(lián)合基金、深圳市杰出人才項目的支持。

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