副溶血性弧菌廣泛存在于海產(chǎn)品、海洋及河口生態(tài)系統中，能夠引發(fā)鰓腐病、蝦紅體病、早死綜合征以及急性肝胰腺壞死病等多種水生物種疾病，給海水養殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。我國水產(chǎn)養殖允許使用氟苯尼考以及部分磺胺類(lèi)和喹諾酮類(lèi)抗生素。由于缺乏嚴格的監控與管理，抗生素濫用加劇了海水養殖環(huán)境中副溶血性弧菌的抗菌素耐藥性問(wèn)題。近年來(lái)，等溫核酸擴增方法在食源性致病菌和耐藥基因（ARGs）檢測中的應用明顯增加。重組酶聚合酶等溫擴增（RPA）技術(shù)能在溫和的溫度條件下，在5-20分鐘內將目標核酸擴增至可檢測水平。然而，氣溶膠交叉污染風(fēng)險阻礙了RPA在現場(chǎng)開(kāi)放環(huán)境的應用。

具有高通量和自動(dòng)化操作能力的微流控技術(shù)，能夠整合樣品處理、核酸擴增和檢測過(guò)程至單一芯片中。其中，離心式微流控芯片利用離心力通過(guò)微通道將樣品及反應體系均勻分布于檢測微孔內，最大程度的降低交叉污染的風(fēng)險，在食源性細菌及ARGs現場(chǎng)檢測方面展現出巨大潛力。近日，中國計量大學(xué)蔣晗副教授和呂晨澤副教授研究團隊開(kāi)發(fā)了一種快速、準確的免疫磁分離（IMS）-RPA-微流控檢測技術(shù)，集成樣品濃縮、核酸提取及等溫擴增步驟，實(shí)現副溶血性弧菌及相關(guān)ARGs的實(shí)時(shí)監測，相關(guān)研究成果以“Simultaneous detection of Vibrio parahemolyticus and antimicrobial resistance genes using immonomagnetic separation combined with RPA-microfluidic method in seafood”為題發(fā)表于高水平期刊Food Control。該研究利用優(yōu)化后的IMS技術(shù)完成樣品的預處理和靶向富集，采用創(chuàng )新設計的離心微流控芯片檢測副溶血性弧菌及其floR、sul1和qnrA基因。與傳統檢測方法相比，該技術(shù)對實(shí)驗條件和操作人員的要求明顯降低，為現場(chǎng)快速監測食源性微生物及其ARGs的挑戰提供可行的解決方案。

圖1 免疫磁分離（IMS）技術(shù)聯(lián)合RPA-微流控法同時(shí)檢測海產(chǎn)品中副溶血性弧菌及其耐藥基因的操作流程及原理示意圖。

該研究使用的微流控芯片為直徑80毫米、厚度2.5毫米的緊湊圓盤(pán)結構，包含8個(gè)獨立單元，每個(gè)單元均設有1個(gè)樣品孔、1個(gè)排氣口和4個(gè)微反應室。每個(gè)微反應室內預先裝載擴增體系混合物。位于微反應室前的球閥負責確保反應混合物能夠順利轉移并填充反應室完成核酸擴增及檢測。在檢測時(shí)，通過(guò)微流控芯片的樣品孔注入樣品液，隨后使用密封膜對樣品孔進(jìn)行封閉。然后，將組裝好的微流控芯片置入檢測裝置中。樣本液通過(guò)離心力均勻分布于各個(gè)反應室內，在設定溫度下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RPA反應。檢測裝置收集和處理每個(gè)反應室的熒光信號，最終獲得樣品液的實(shí)時(shí)擴增曲線(xiàn)。

圖2 副溶血性弧菌高度保守的物種特異性基因toxR和3個(gè)耐藥基因floR、sul1和qnrA的RPA-微流控芯片檢測平臺原理圖。

免疫磁珠（IMB）的數量顯著(zhù)影響IMS方法的靈敏度，為獲得最佳的捕獲效率（CE），研究人員實(shí)驗了多種濃度的IMB，根據結果確定0.4 mg為副溶血性弧菌最佳使用量。同時(shí)測試獲得最佳孵育時(shí)間和孵育溫度。當副溶血性弧菌在10? CFU/mL時(shí)，CE約為91.87% ± 1.8%，非目標細菌的CE保持在15%以下，因此優(yōu)化后的IMS技術(shù)對副溶血性弧菌具有明顯的特異性。

圖3 優(yōu)化IMS技術(shù)的（A）免疫磁珠（IMB）用量、（B）孵育時(shí)間、（C）分離時(shí)間、（D）副溶血性弧菌濃度、（E）特異性。

研究團隊采用常規培養法、qPCR法和該研究開(kāi)發(fā)的IMS-RPA微流控法三種方法對180份實(shí)際樣本進(jìn)行分析檢測分析。結果顯示，共有112個(gè)樣本被確定為副溶血性弧菌陽(yáng)性，三種方法獲得結果一致性達到100%。采用IMS-RPA-微流控技術(shù)和qPCR檢測112株副溶血性弧菌中floR、sul1和qnrA 這3種ARGs的存在情況。檢測結果證實(shí)IMS-RPA微流控方法具有優(yōu)異的特異性、靈敏度和檢測精度，該技術(shù)高效、可靠，能夠同時(shí)檢測海產(chǎn)品樣品中的副溶血性弧菌和多種ARGs。

圖4 （A-G）RPA-微流控法同時(shí)檢測海產(chǎn)品樣品中副溶血性弧菌及其耐藥基因floR、sul1和qnrA；（H）芯片上各功能單元的詳細視圖。

論文信息：

https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2024.110653

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