當前位置： 首頁(yè) - 新聞中心 - 專(zhuān)業(yè)知識
文章信息
期刊名稱(chēng)：《Journal of Advanced Research》
文章標題：《Development of a novel Cas13a/Cas12a-mediated “one-pot”dual detection assay for genetically modified crops》
影響因子：11.4
研究團隊：浙江省農業(yè)科學(xué)院汪小福
原文鏈接：http://www.amp-future.com/vip_doc/28586987.html
轉基因作物已在世界各地廣泛種植，許多國家逐步完善轉基因監管措施以確保轉基因作物的安全。開(kāi)發(fā)快速和準確的轉基因現場(chǎng)檢測方法對農業(yè)和生物安全非常重要，可以減輕公眾對轉基因產(chǎn)品的擔心。
在本研究中，課題組開(kāi)發(fā)了一種新的一鍋法反應——雙重MIRA檢測結合雙重CRISPR（MR-DCA方法），用于同時(shí)檢測轉基因作物中的CaMV35S和NOS遺傳靶點(diǎn)，為轉基因作物的檢測提供了一種簡(jiǎn)單高效的方法。
Part 01實(shí)驗方法
將雙重MIRA產(chǎn)物用雙Cas13a、Cas12a系統進(jìn)行分析，產(chǎn)生兩個(gè)互不干擾的獨立信號，再通過(guò)照明儀器讀取熒光顏色，或通過(guò)帶有兩條T線(xiàn)的試紙條，以實(shí)現雙通道讀出。整個(gè)過(guò)程在不到35min的時(shí)間內完成，檢測限低至20個(gè)拷貝。
（MR-DCA檢測CaMV35S和NOS的原理）
整個(gè)實(shí)驗分為3個(gè)步驟：MIRA擴增、CRISPR反應、2種方式的結果判讀。
CaMV35S基因作為Cas13a的靶標，NOS基因作為Cas12a的靶標，分別設計了兩對MIRA引物。Cas13a系統只識別RNA，因此設計了正向引物區域，包含一個(gè)T7啟動(dòng)子，用于后續轉錄，激活Cas13a。為NOS基因增加一個(gè)PAM 。以上的這些的添加確保了Cas13a和Cas12a蛋白都可以與各自的crRNA結合，且兩個(gè)系統之間不存在干擾或交叉反應。
Part 02實(shí)驗情況
靈敏度和特異性
將樣本梯度稀釋來(lái)測試MIRA反應的熒光強度，發(fā)現樣本濃度在20μL時(shí)仍能檢測到熒光強度，最終實(shí)驗選定20μL的濃度。
（不同樣本濃度和熒光強度測試）
（不同樣本濃度和試紙條顯色測試并用強度量化計算）
為了進(jìn)一步評價(jià)MR-DCA的特異性，課題組對非轉基因動(dòng)物混合樣品和非轉基因植物混合樣品進(jìn)行了檢測。結果顯示只有含有CaMV35S和NOS的轉基因樣品具有較高的熒光信號，而其他樣品的熒光強度與陰性對照比較接近。MR-DCA可作為一種特定的雙靶點(diǎn)核酸檢測平臺。
用MR-DCA對24個(gè)作物樣品進(jìn)行了測試。其中1、2、15、16、21、22是含有CaMV35S啟動(dòng)子的轉基因玉米。7、8、23、24是含有NOS終止子的抗病轉基因水稻。3、4、11、12、13、14、17、18是含有CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子轉基因大豆。
（24個(gè)樣本的檢測結果）
反應快速
反應時(shí)間是現場(chǎng)檢測的一個(gè)重要因素，課題組觀(guān)察到在反應時(shí)間為10 min時(shí)，就已經(jīng)能用熒光儀檢測到FAM和HEX的熒光信號。MIRA結合CRISPR反應，也在15min后觀(guān)察到黃色熒光。
（不同MIRA反應時(shí)間下的熒光信號）
（MIRA反應不同時(shí)間下的試紙條顯色并用強度量化計算）
實(shí)驗結論
實(shí)驗結果表明，該雙重MIRA具有良好的特異性，并能準確地獲得CaMV35S和NOS的擴增產(chǎn)物，Cas13a和Cas12a系統獨立反應，互不干擾。MR-DCA檢測能在35min的低溫下準確檢測到20個(gè)拷貝，具有在田間檢測轉基因作物的巨大價(jià)值。
相關(guān)產(chǎn)品：
MIRA試劑盒及試紙條系列：
|
貨號 |
產(chǎn)品 |
規格 |
|
JY0209 |
雙靶標HybriDetect側向層析試紙條（彩虹型） |
50T |
|
JY0201 |
單靶標HybriDetect側向層析試紙條（彩虹型） |
50T |
|
JY0307 |
Tiosbio? CRISPR單酶切及擴增產(chǎn)物檢測試紙條 |
50T |
|
JY0301 |
CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條 |
50T |
|
JY0308 |
Tiosbio? CRISPR雙酶切檢測試紙條（變色龍） |
50T |
|
WLB8201KIT |
DNA恒溫快速擴增試劑盒（基礎型） |
48T |
|
WLE8202KIT |
DNA恒溫快速擴增試劑盒（熒光型） |
48T |
|
WLN8203KIT |
DNA恒溫快速擴增試劑盒（膠體金試紙條型） |
48T |
|
WLRB8204KIT |
RNA恒溫快速擴增試劑盒（基礎型） |
48T |
|
WLRE8205KIT |
RNA恒溫快速擴增試劑盒（熒光型） |
48T |
|
WLRN8206KIT |
RNA恒溫快速擴增試劑盒（膠體金試紙條型） |
48T |
|
WLB5001 |
DNA恒溫快速擴增試劑盒（液體基礎型） |
100T |
|
WLN5002 |
DNA恒溫快速擴增試劑盒（液體膠體金型） |
100T |
|
WLR5003 |
DNA恒溫快速擴增試劑盒（液體熒光型） |
100T |
|
WLRB5001 |
RNA恒溫快速擴增試劑盒（液體基礎型） |
100T |
|
WLRN5002 |
RNA恒溫快速擴增試劑盒（液體膠體金型） |
100T |
|
WLRE5003 |
RNA恒溫快速擴增試劑盒（液體熒光型） |
100T
|
Cas酶系列
|
貨號 |
包裝規格 |
中文名稱(chēng) |
|
32108-01 |
100 pmoL |
LbCas12a (Cpf1) |
|
32108-03 |
1,000 pmoL |
LbCas12a (Cpf1) |
|
32117-01 |
100 pmoL |
LwaCas13a (C2c2) |
|
32117-03 |
1,000 pmoL |
LwaCas13a (C2c2) |
|
32118-01 |
100 pmoL |
AapCas12b (C2c1) |
|
32118-03 |
1,000 pmoL |
AapCas12b (C2c1) |
|
32119-01 |
100 pmoL |
Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
|
32119-03 |
1,000 pmoL |
Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
|
32104-01 |
100 pmoL |
AsCas12a (Cpf1) |
|
32104-03 |
1,000 pmoL |
AsCas12a (Cpf1) |
|
32116-01 |
100 pmoL |
AacCas12b (C2c1) |
|
32116-03 |
1,000 pmoL |
AacCas12b (C2c1) |
|
32106-01 |
100 pmoL |
FnCas12a (Cpf1) |
|
32106-03 |
1,000 pmoL |
FnCas12a (Cpf1) |
|
32110-01 |
100 pmoL |
Lb5Cas12a (Cpf1) |
|
32110-03 |
1,000 pmoL |
Lb5Cas12a (Cpf1) |
|
32101-01 |
100 pmoL |
SpCas9 |
|
32101-03 |
1,000 pmoL |
SpCas9 |
|
32102-01 |
100 pmoL |
Sp-dCas9 |
|
32102-03 |
1,000 pmoL |
Sp-dCas9 |
|
32120-01 |
100 pmoL |
Sp-nCas9（H840A） |
|
32120-03 |
1,000 pmoL |
Sp-nCas9（H840A） |
- 上一頁(yè)： 橫向流動(dòng)試紙條LFD試紙，為什么要做成Red-Blue雙色
- 下一頁(yè)： 免疫磁分離-RPA-微流控檢測技術(shù)，用于檢測食源性致病菌及其耐藥基因