建立靈敏、快速的RPA檢測，依賴(lài)于合適擴增引物的選擇。由于目前還不能完全根據引物的序列特征來(lái)預測其擴增性能，建議通過(guò)實(shí)驗的方式來(lái)篩選一些列候選引物來(lái)確定最優(yōu)引物對。

Note：對于檢測要求不高的實(shí)驗（模板超過(guò)1000個(gè)拷貝），大多數情況下只需要進(jìn)行少量篩選，即可找到合適引物對，甚至使用PCR引物就足以用于反應。對于高靈敏度分析，建議按照以下設計方案進(jìn)行篩選。

1.     靶序列的選擇

如果是用于檢測臨床樣本，那么合適的靶序列，一定是盡可能保守的。雖然RPA技術(shù)對引物和模板之間的匹配要求不是那么嚴謹，但是過(guò)多不匹配的堿基，必然會(huì )影響擴增的效率，從而使得準確率和靈敏度下降。

2.     引物長(cháng)度

為PCR設計的引物通?？梢杂糜赗PA反應，但擴增效率可能不高。RPA引物的理想長(cháng)度為30~35bp，比典型的PCR引物長(cháng)。不同于PCR反應，RPA反應的過(guò)程不依賴(lài)于溫度變化，因此引物的Tm值和RPA反應擴增效率之間沒(méi)有很強的關(guān)聯(lián)性。相反，許多RPA引物也可用于PCR擴增，但它們在PCR中的擴增性能可能與其作為RPA引物的擴增性能沒(méi)有直接關(guān)系。

短于30bp的引物仍然可以用于RPA反應。然而，與>30bp的引物相比，其擴增效率通常更低。對于大于35bp的引物，其依然有可能獲得很好的擴增性能。但是引物越長(cháng)，其形成引物二聚體的可能性越大，反而影響特異產(chǎn)物的擴增效率。因此，不建議設計過(guò)長(cháng)的引物。

3.     引物序列

引物的序列直接的影響著(zhù)RPA反應的擴增效率，目前還不能完全根據引物的序列來(lái)預測其擴增性能。雖然有一些根據經(jīng)驗觀(guān)察而建立的指南，但這并不能替代實(shí)驗的方式來(lái)檢驗引物的實(shí)際效率。

在大多數的情況下，最好避免引物中特殊的序列結構，例如某個(gè)特定連續的核苷酸或大量的短重復。GC含量過(guò)高(>70%)或過(guò)低(<30%)可能不利于反應。另外，盡量避免可在引物內部或者引物引物之間形成引物二聚體或者發(fā)夾結構的序列。

         4.     擴增產(chǎn)物長(cháng)度

Note：引物噪音即擴增反應中由引物產(chǎn)生的非特異擴增。由于引物噪音的影響，RPA中的擴增產(chǎn)物的大小直接影響著(zhù)擴增反應的靈敏度和速度。雖然引物的噪音與RPA產(chǎn)物的長(cháng)度無(wú)關(guān)，但更長(cháng)的RPA產(chǎn)物需要更長(cháng)的倍增時(shí)間。因此，擴增產(chǎn)物越長(cháng)，引物噪音的擴增越有可能超過(guò)目的片段的擴增。所以，較短的擴增產(chǎn)物對超敏度分析有利。

如果在檢測中使用探針，那么在設計RPA擴增引物時(shí)必須注意為探針的設計留出足夠的序列空間。

5.     引物選擇

引物選擇過(guò)程通常包括以下步驟:

1)    目標序列的選擇：

建議在模板中選擇一個(gè)區域，其特征在于相對“平均”的核苷酸序列組成:

l  GC含量在40%和60%之間

l  重復序列

l  少數正向/反向重復，回文

       盡量避免選擇擴增模板中的重復序列以保證目標序列的唯一性。在這方面，目標序列的選擇與PCR中的選擇原則一致。

2)    候選引物

選擇合適的目標區域后，選擇兩組相互面對(即具有正向和反向)的交錯引物作為候選引物。相同方向的引物可以重疊，但不是必須重疊。來(lái)自正向組的每條引物可以隨后與來(lái)自反向組的每條引物配對。篩選一對可用于檢測單分子DNA模板并且倍增時(shí)間短于20秒（RPA指數擴增期，產(chǎn)物增加一倍所需的時(shí)間）的引物，通常需要每個(gè)方向有8-10條候選引物（也就是說(shuō)，64-100對引物組合）。

如果對引物的擴增效率要求不高(例如：樣品中被檢測的樣本濃度相對較高)，可以在PCR引物設計軟件中直接設定以下參數:

l  引物大小最小30bp，最大36bp

l  引物GC%最低20，最高70

l  引物Tm最低50，最高100

l  單核苷酸重復的最大允許長(cháng)度，例如“CCCCC”設置為5。

3)    引物的篩選

見(jiàn)引物的三級篩選。

6.     困難的擴增

在某些情況下，擴增序列內部的基序(即引物之間的序列)對快速擴增不利，并且只要擴增產(chǎn)物中包含了這段序列基序的引物都表現不佳。嘗試為特定的目的區域設計合適的引物，卻始終無(wú)法達到預期目標的擴增。那么，如果可以的話(huà)，盡量選擇其它不含這段基序的區域作為目標擴增區域。

7.     引物噪音

       通常除了特異性擴增發(fā)生之外，RPA反應體系也容易引起引物之間非特異性擴增的發(fā)生。這種非特異性擴增可以是由分子內的(發(fā)夾結構)序列引起，也可以是由相同或不同引物之間的序列所引起。這種非特異性擴增可以產(chǎn)生可檢測水平的信號，即引物的噪音。噪音反應與特異性擴增過(guò)程競爭(對于引物、核苷酸、聚合酶結合和能量),并將最終抑制后者。產(chǎn)生噪音的傾向會(huì )影響特定引物對的靈敏度。由于這個(gè)原因，引物的選擇尤為重要。

8.     簡(jiǎn)并引物和錯配

RPA通常對錯配是耐受的。有研究表明，當引物和探針攜帶5-9個(gè)堿基對錯配時(shí)，RPA的擴增性能可能不受影響。因此，可以盡量減少在RPA反應中使用簡(jiǎn)并堿基。

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