一、研究背景

乙型流感病毒（Flu B）是一種極具傳染性的呼吸道病原體，每年會(huì )引發(fā)大量感染和死亡病例，尤其在冬季高發(fā)，還可能導致腦炎、細菌性肺炎等嚴重并發(fā)癥。目前，雖有疫苗和抗病毒藥物，但 Flu B 的抗原變異使其效果受限，因此急需快速準確的診斷方法。

傳統的 Flu B 診斷方法，如病毒分離、抗原檢測和血清學(xué)檢測，耗時(shí)較長(cháng)，無(wú)法滿(mǎn)足快速診斷的需求。近年來(lái)，基于 PCR 的分子診斷方法廣泛應用，但存在依賴(lài)昂貴設備、需要專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員操作以及反應時(shí)間長(cháng)等缺點(diǎn)。等溫擴增技術(shù)，像環(huán)介導等溫擴增（LAMP）和重組酶聚合酶擴增（RPA），能在恒溫下進(jìn)行，無(wú)需特殊熱循環(huán)設備和大量消耗試劑，不過(guò)非特異性擴增產(chǎn)物會(huì )影響其特異性.

二、材料與方法

RPA 引物設計與篩選：從 NCBI 數據庫下載 Flu B 核酸序列，根據特定保守區域設計 3 條正向（F1 - F3）和 3 條反向（R1 - R3）RPA 引物，由生工生物合成。用購買(mǎi)的 Flu B 假病毒產(chǎn)品提取的 RNA 作模板，將引物兩兩組合，用商業(yè)試劑盒進(jìn)行 RPA 擴增，擴增條件為 38°C 孵育 30 分鐘，1000 copies / 測試 RNA 模板。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物質(zhì)量，篩選最佳引物組合。

crRNA 設計與篩選：根據選定引物序列，設計 6 條 Cas12a crRNA（crRNA1 - crRNA6），由商業(yè)試劑盒合成。在一鍋法 Flu B 檢測系統中評估篩選，選擇檢測效率最高的 crRNA 用于后續實(shí)驗。 

一鍋法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 系統條件優(yōu)化：一鍋法 Flu B 檢測系統包括 RT - RPA 擴增和 CRISPR/Cas12a 檢測兩部分。RT - RPA 反應總體積 24μL，含特定濃度引物、RNA 模板、激活劑和無(wú)核酸酶水，在 38°C 反應 30 分鐘。CRISPR/Cas12a 檢測系統總體積 10μL，含特定緩沖液、Lb5Cas12a、crRNA 和單鏈 DNA（ssDNA）報告探針，在不同溫度下孵育 10 分鐘，設置不同工作溫度、Cas12a 濃度、crRNA6 濃度和 ssDNA 探針類(lèi)型進(jìn)行優(yōu)化，收集熒光強度數據。

一步法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 系統條件優(yōu)化：一步法 Flu B 檢測系統總體積 25μL，包含多種試劑。設置不同工作溫度、Cas12a 濃度、crRNA6 濃度和 ssDNA 探針類(lèi)型，在不同溫度下反應 45 分鐘，每分鐘收集熒光信號進(jìn)行優(yōu)化。 

敏感性分析：構建含 Flu B 片段的重組質(zhì)粒，稀釋為不同濃度（200 copies / 測試、100 copies / 測試、50 copies / 測試、25 copies / 測試），每個(gè)濃度進(jìn)行 10 次重復反應。用 Sigmoid 函數根據陽(yáng)性結果預測一步法檢測的最低檢測限（LOD）。

特異性檢測：收集 6 種干擾樣本（A 群鏈球菌（GAS）、鮑曼不動(dòng)桿菌（AB）、人副流感病毒（HPIV）、肺炎支原體（MP）、肺炎克雷伯菌（KP）和 H1N1 禽流感病毒（H1N）），以 Flu B 假病毒核酸為陽(yáng)性對照，無(wú)核酸酶水為陰性對照，用一步法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 檢測系統進(jìn)行檢測，每個(gè)樣本重復 3 次。

臨床樣本驗證：淮北人民醫院提供 101 份咽拭子樣本，用商業(yè)試劑盒提取 RNA 作模板進(jìn)行 RT - RPA 反應。同時(shí)用一鍋法和一步法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 方法檢測樣本，以 PCR 方法檢測結果為金標準，分析兩種方法與 PCR 方法的一致性。 

數據處理與統計分析：檢測結果用相對熒光倍數表示，每個(gè)樣本至少檢測 3 次生物學(xué)重復，數據以平均值 ± 標準差表示。用 GraphPad Prism 10 軟件進(jìn)行統計分析，通過(guò) Student’s t 檢驗評估統計學(xué)差異，用 Sigmoid 函數預測 LOD，P < 0.05 為差異有統計學(xué)意義。 

三、研究結果

檢測系統工作流程：一鍋法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a Flu B 檢測系統中，RT - RPA 反應在管底進(jìn)行，CRISPR/Cas12a 檢測系統在管蓋準備。Flu B 靶序列經(jīng) RT - RPA 擴增后，通過(guò)短時(shí)間離心將 CRISPR/Cas12a 檢測系統混入 RT - RPA 反應體系，借助 FAM 標記的 ssDNA 探針釋放熒光信號，40 分鐘內可完成檢測。一步法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 系統將兩種檢測試劑整合在一個(gè)反應中，45 分鐘內完成反應并在熒光信號檢測儀上分析。

引物和 crRNA 篩選結果：通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳評估 9 種引物組合的擴增產(chǎn)物，確定 F1/R2 為最佳引物組合。在一鍋法檢測系統中篩選 6 條 crRNA，發(fā)現 crRNA6 檢測效率最高，因此選擇 crRNA6 用于后續實(shí)驗。

系統條件優(yōu)化結果：一鍋法系統中，確定 Cas12a 最佳工作溫度為 42°C，最佳濃度為 250nM，P8C 的 ssDNA FAM 標記探針性能最佳。一步法系統中，最佳反應溫度為 40°C，Cas12a 最佳濃度為 125nM。

敏感性和特異性檢測結果：一鍋法和一步法檢測系統對不同濃度重組質(zhì)粒的檢測結果顯示，兩者檢測率相同，一步法檢測系統的 LOD 為 58 copies / 測試。特異性檢測中，只有陽(yáng)性對照樣本產(chǎn)生明顯熒光信號，干擾樣本無(wú)明顯信號，表明一步法檢測系統對 Flu B 檢測特異性高，無(wú)交叉反應。

臨床樣本驗證結果：101 份臨床咽拭子樣本檢測結果顯示，一鍋法檢測系統敏感性為 81.25%，特異性為 98.82%，與 PCR 方法一致性為 96.03%；一步法檢測系統敏感性為 56.25%，特異性為 100%，與 PCR 方法一致性為 93.06%。

四、討論

本研究開(kāi)發(fā)的一步法 Flu B 檢測系統，整合 RT - RPA 和 CRISPR/Cas12a 技術(shù)，能在 45 分鐘內特異性識別 Flu B，LOD 為 58 copies / 測試。與 PCR 方法相比，該系統特異性高（100%），總體一致性達 93.06%，有助于 Flu B 的早期診斷和精準治療。

目前基于 RT - RPA 的平臺雖能在 1 小時(shí)內篩查流感病毒和新冠病毒，敏感性可達 10 copies 病毒 RNA，但非特異性擴增產(chǎn)物導致的假陽(yáng)性限制了其應用?；?RPA - CRISPR/Cas12a 的 Flu B 檢測方法敏感性雖高，但多為兩步法，需開(kāi)蓋操作，增加氣溶膠污染風(fēng)險，操作復雜，不利于臨床應用。本研究的一步法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 系統在單管內完成所有反應，無(wú)需開(kāi)蓋，避免氣溶膠污染，成本降低 75%，主要通過(guò)減少反應體積和降低 Cas12a 濃度實(shí)現，同時(shí)抑制了 Cas12a 的順式切割活性。

與 PCR 相比，PCR 的高 Ct 值會(huì )導致 “灰色地帶” 問(wèn)題，而本研究的一鍋法和一步法檢測系統在臨床樣本中特異性和一致性高，有效避免該問(wèn)題。不過(guò)，一步法檢測系統在臨床樣本中的敏感性（56.25%）低于一鍋法（81.25%），可能與單一反應條件和臨床樣本中病毒載量低有關(guān)，且本研究臨床樣本數量有限，后續需擴大樣本量驗證。

此外，Cas12a 的順式切割活性影響一步法反應的敏感性，本研究通過(guò)優(yōu)化反應溫度和 Cas12a 濃度降低其影響。同時(shí)，其他技術(shù)如光控 crRNA 激活系統和基于水凝膠的檢測平臺等不斷發(fā)展，有望進(jìn)一步提高一步法 RT - RPA - CRISPR/Cas12a 系統檢測 Flu B 及其他 RNA 病毒的性能。

綜上所述，本研究開(kāi)發(fā)的一鍋、一步法 Flu B 檢測系統，操作簡(jiǎn)便、快速準確、無(wú)污染，所有試劑可凍干預制備，為 Flu B 的即時(shí)診斷奠定基礎，也為一步法 CRISPR/Cas 系統在其他病原體分子診斷中的應用提供參考。

相關(guān)產(chǎn)品：RPA試劑盒及試紙條系列：

Cas酶系列